卵巢癌患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞的檢測及其臨床意義

溫 巖,孫曉艷,何 津,于曉偉*

(吉林大學第一醫院 1 .婦產科;2.放射科,吉林 長 春 130021)

卵巢癌患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞的檢測及其臨床意義

溫 巖1,孫曉艷2,何 津1,于曉偉1*

(吉林大學第一醫院 1 .婦產科;2.放射科,吉林 長 春 130021)

目的探討卵巢癌患者CD4+CD25+調節性T細胞的比例變化及其可能的機制。方法利用流式細胞儀檢測20例卵巢癌患者外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)及腫瘤相關淋巴細胞(tumor associated lymphocytes,TALs)中CD4+CD25+調節性 T細胞(CD4+CD25+T cells,Tregs)所占的比例。10例健康人外周血PBLs中Tregs所占的比例。同時檢測卵巢癌患者CD4+外周血淋巴細胞中CD69+細胞的比例。健康人PBLs在含有卵巢癌細胞株SKOV3培養上清的RPMI1640培養液(有或沒有血清植物血凝素)中培養72小時后,檢測Tregs所占的比例。結果卵巢癌患者外周血淋巴細胞中CD4+CD25+調節性T細胞所占比例與健康人相比明顯增加.卵巢癌患者外周血腫瘤浸潤淋巴細胞中CD4+CD25+調節性T細胞所占比例高于在外周血淋巴細胞和腫瘤相關淋巴細胞中的比例,但是沒有統計學意義。卵巢癌患者CD4+外周血淋巴細胞中無CD69表達。結論卵巢癌患者外周血淋巴細胞中、腫瘤浸潤淋巴細胞及腫瘤相關淋巴細胞中CD4+CD25+調節性T細胞所占的比例增加,這可能與卵巢癌細胞分泌的可溶性分子上調有關。

卵巢癌;免疫抑制;調節性T細胞

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1402)

卵巢癌的致死率占各類婦科腫瘤的首位,5年生存率僅為25%-30%,嚴重威脅著女性的生命健康。隨著免疫學和基因工程技術的迅速發展,免疫治療已被認為是提高卵巢癌患者存活率的一種治療選擇,進而關于卵巢癌細胞免疫的研究就引起了研究者的關注。腫瘤局部免疫微環境中,可見到腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)或其它免疫細胞,但免疫細胞的數量、表型和功能卻與正常人組織中的免疫細胞有著巨大差別,其中Tregs在腫瘤免疫中尤為引人關注,是影響TIL體內抗腫瘤效果的主要因素。Tregs是T細胞的一種,主要指CD4+CD25+Treg,具有阻止自身免疫病和炎癥疾病的發生,也能抑制有效的抗腫瘤免疫應答[1-3]。CD4+CD25+Treg約占人和小鼠外周血CD4+T細胞的5%-10%。大量研究表明,在大多數腫瘤患者中抗腫瘤免疫功能低下與 CD4+CD25+Treg有關[4-6]。目前研究發現多種腫瘤患者外周血和腫瘤區域及淋巴結中Treg的比重顯著高于正常人。已經證實,通過各種途徑清除CD4+CD25+Treg或下調其活性可顯著增加其抗腫瘤活性[7-11]。從臨床角度研究腫瘤患者體內CD4+CD25+Treg數量和功能的變化,揭示這種變化和疾病發生、發展的關系,可為腫瘤的免疫治療提供理論依據。本文探討卵巢癌患者CD4+CD25+Treg的比例變化及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 20例卵巢癌患者均為2007年10月-2009年1月在本院婦產科住院患者,經手術病理均證實為上皮性卵巢癌。FIGO分期:Ⅰ期3例,Ⅱ期2例,Ⅲ期12例,Ⅳ期3例。病理類型:16例漿液性上皮性卵巢癌,4例粘液性上皮性卵巢癌。年齡44-65歲,平均 56.3±12.7歲。10例正常對照組均為門診健康體檢者,年齡20-57歲,平均52.3±10.1歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人IgG抗體,FITC-抗CD25抗體、PE-CY5抗CD4抗體、FITC-抗CD69抗體及同型對照抗體均購自美國CALTAG公司。RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國HyClone公司。胰蛋白酶購自美國Sigma公司。卵巢癌細胞株SKOV3購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)。

1.2.2 PBLs,TILs,and TALs細胞分離 外周血利用胎牛血清2∶1稀釋,利用密度梯度分離法分離,室溫下2 500 rpm25分鐘,獲得PBLs。

腫瘤組織無菌條件下粉碎胰蛋白酶消化25分鐘,取懸浮液過濾后,PBS洗3次,利用密度梯度分離法分離,室溫下2 500 rpm25分鐘,收集下層細胞,獲得TILs。

腹水或腹腔沖洗液室溫下1 500 rpm離心15分鐘,利用密度梯度分離法分離,室溫下2 500 rpm25分鐘,收集下層細胞,獲得TALs。

1.2.3 流式細胞儀 樣品應用EPICS XL-ADC流式細胞分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)上機檢測,檢測PBLs,TILs,and TALs細胞中CD4+CD25+T細胞的比例;卵巢癌患者CD4+PBL中CD69+細胞的比例。

1.2.4 細胞培養 卵巢癌細胞株SKOV3在加有10%熱滅后胎牛血清的RPMI1640培養液中培養,80%匯聚后再在未加入胎牛血清的RPMI1640培養液中培養48小時,離心濾過后取上清,-20℃保存。

為了探討卵巢癌細胞株培養液對CD4+CD25+調節性T細胞的效應,10例健康人 PBLs在 RPMI1640培養液中培養,培養72小時后加入卵巢癌細胞株SKOV3培養液。后者再分為加入PHA及未加入PHA兩組,上機檢測不同情況的CD4+CD25+T細胞的比例。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 卵巢癌患者CD4+CD25+調節性T細胞比例增加

卵巢癌患者PBLs中CD4+CD25+調節性T細胞占CD4+T細胞的32.45%,與正常對照組(5.2%)相比明顯增加,差異顯著(P＜0.05)。見圖1。

卵巢癌患者TILs和 TALs中CD4+CD25+調節性T細胞所占的比例分別為43.8%、33.6%;晚期卵巢癌患者 PBL、TIL及 TAL中 CD4+CD25+調節性 T細胞所占比例高于早期卵巢癌患者,但沒有統計學意義(P＞0.05)。卵巢癌患者CD4+PBLs中CD69表達陰性。見圖2。

2.2 卵巢癌細胞株SKOV3培養液可以增加CD4+CD25+T細胞的表達

正常健康人PBLs在RPMI1640加入50%卵巢癌細胞株SKOV3培養液(有或沒有PHA,10 μ g/ml))中培養后,CD4+CD25+Tregs所占比例高于沒有加入卵巢癌細胞株SKOV3培養液中的比例。見表1。

圖1 A正常健康人PBLs中CD4+CD25+調節性T細胞流式檢測結果 B-D卵巢癌患者PBLs、TILs及TAL中CD4+CD25+調節性T細胞流式檢測結果

圖2 卵巢癌患者 CD4+PBLs中 CD69的表達陰性

表1 卵巢癌細胞株培養液對CD4+CD25+Tregs的效應

3 討論

近年來研究表明許多腫瘤抗原為自身抗原,CD4+CD25+tregs能抑制T細胞對外來和自身抗原的免疫應答,因而在維持對自身成分耐受的同時也會阻止機體對腫瘤細胞的免疫應答,從而導致了腫瘤的免疫逃逸。1999年Onizuka[12]首先通過實驗證明CD4+CD25+Treg抑制針對腫瘤的免疫應答,使人們開展了對這類細胞和腫瘤相互關系的基礎理論研究。

Wolf和Ormandy等[13-15]發現在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、肝癌等多種腫瘤患者外周血和腫瘤局部CD4+CD25+Treg比例增高,且數量與患者腫瘤進展程度和預后呈負相關。Woo等報道大于30%肺癌患者CD4+PBLs and TILs共表達CD25[13]。本研究發現卵巢癌患者PBLs中CD4+CD25+Treg明顯增加,而且晚期患者Treg相對更高,提示卵巢癌患者體內存在CD4+CD25+Treg增高。CD4+CD25+Treg增高可能激活了宿主對于腫瘤的免疫抑制作用。同時本研究還發現卵巢癌患者TIL中CD4+CD25+Treg所占比例明顯高于PBLs和TALs中的比例,但是沒有統計學意義,這提示腫瘤局部微環境中免疫受抑制更明顯。CD69是T細胞活化的標記物之一。本研究發現卵巢癌患者CD4+PBLs中CD69表達陰性,提示卵巢癌患者 CD4+CD25+調節性T細胞增加并不是由于活化T細胞的增加。

腫瘤患者外周血、淋巴結和腫瘤局部CD4+CD25+Treg數量增加,這一現象可能的解釋有兩種:腫瘤誘導的調節性T細胞的增殖;或調節性T細胞對腫瘤抗原刺激的生理性增殖。至今仍缺乏實驗室證據證明上述任何一種假說。為了探討卵巢癌患者局部微環境中CD4+CD25+Treg增加的機制。本研究檢測了健康人PBLs培養基中加入卵巢癌細胞株SKOV3培養液前后CD4+CD25+Treg的比例變化,結果顯示加入卵巢癌細胞株SKOV3培養液后CD4+CD25+Treg的比例增加。為了進一步證實這種變化不是由于活化T細胞增殖的原因,本研究繼續在上述加入卵巢癌細胞株SKOV3培養液的PBLs培養基中加入PHA,CD4+CD25+Treg的比例同步增加。因此推測卵巢癌上皮細胞分泌一定的可溶性分子,他們誘導卵巢癌患者外周血及腫瘤局部微環境中的CD4+CD25+Treg增加。

本研究結果顯示卵巢癌患者體內CD4+CD25+Treg增加,推測是由于卵巢癌上皮細胞分泌的可溶性分子有關。由此,探討卵巢癌局部微環境中CD4+CD25+Treg增加的原因及如何清除CD4+CD25+Treg或下調其活性,成為提高TIL卵巢癌免疫治療效果的焦點。

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The detection of CD4+CD25+regulatory T cells of ovarian cancer patients and clinical significance

WEN Yan,SUN Xiaoyan,HE Jin,et al.(The First Hospital of Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo study the frequence of the CD4+CD25+regulatory in the patientswith ovarian carcinoma and its possible mechanism.MethodsThe percentages of CD4+CD25+T cells in the peripheral blood lymphocytes(PBLs),tumorinfiltrating lymphocytes(TILs)and tumor associated lymphocytes(TALs)from 13 patients with ovarian carcinoma and in the PBLs from 14 healthy women were determined by flow cytometry.The expression of CD69 on CD4+PBLs from thepatients was detected.PBLs from healthy women were cultured in complete RPMI 1640 containing the supernatant from SKOV3 cell line with or without PHA(phytohemagglutinin)stimulationfor 72 hours,then the percentage of CD4+CD25+T cellswas detected.ResultsCD4+CD25+T cells in the PBLsfrom patientswith ovarian carcinoma were significantly increased comparedwith the control.The percentage of CD4+CD25+T cells in TILs was higher than that inPBLs and TALsfrom the patients,but not significantly.The expression of CD69 on CD4+PBLs from the patientswas negative.ConclusionThere is anincreasing of the proportion of CD4+CD25+T cells in PBLs,TILs and TALs of the patients with ovarian carcinoma,which probably results from up-regulation ofsoluble factor secreted by ovarian carcinoma cells.

Ovarian carcinoma;Immunosuppression;regulatory T cell

R737.31

A

1007-4287(2010)09-1402-04

吉林省科技廳白求恩基金資助(20070175)

*通訊作者

2009-12-07)