膀胱出口梗阻對逼尿肌結構蛋白及轉化生長因子β1表達的影響

魏小斌,白志明,劉振湘,呂 蔡

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院 1 .檢驗科;2.泌尿外科;海南 海 口 570208)

膀胱出口梗阻對逼尿肌結構蛋白及轉化生長因子β1表達的影響

魏小斌1,白志明2,劉振湘2,呂 蔡2

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院 1 .檢驗科;2.泌尿外科;海南 海 口 570208)

目的探討膀胱出口梗阻(BOO)后逼尿肌中結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1(TGF-β1)mRNA表達的改變。方法應用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測BOO組(16例)和對照組(5例)膀胱上壁組織中結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及TGF-β1 mRNA表達。結果BOO組與對照組膀胱重量分別為(92.15±34.89)g和(56.08±20.35)g,(P＜0.05);前列腺內外徑比值分別為(0.57±0.16)和(0.18±0.06),(P＜0.05);對照組結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1 mRNA的表達量分別為(2.4±2.1)×106、(2.2±0.9)×106、(0.60±0.56)×106、(2.63±1.36)×106和(0.18±0.13)×106拷貝數/μ g總 RNA;與對照組相比,BOO 組結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1 mR NA的表達量均有顯著增加,分別為(25.0±31.0)×106、(20.0±25.0)×106、(6.59±5.62)×106、(40.32±59.67)×106和(3.60±7.30)×106拷貝數/μ g總 R NA(P值均＜0.01)。結論膀胱逼尿肌中結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1 mRNA的表達與逼尿肌的功能狀態密切相關。

逼尿肌;膀胱結蛋白;波形蛋白;肌球蛋白;肌動蛋白;轉化生長因子β1

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1408)

通過尿動力學壓力-流率檢查篩選病例,應用熒光定量PCR方法檢測良性前列腺增生癥(BPH)引起膀胱出口梗阻(BOO)病人膀胱逼尿肌組織中結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1mRNA的表達,以探討BOO引起膀胱逼尿肌結構及功能改變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

BOO組16例,均為男性,年齡54-83歲,平均73.8歲,來自2003年6月至2005年6月我院泌尿外科住院患者,入院均診斷為BPH,并行尿動力學壓力-流率檢查為高壓-低流型。對照組5例,平均年齡67.2歲,其中外傷致膀胱破裂1例、尿道斷裂2例,輸尿管壁間段結石2例,均排除有下尿路梗阻病史可能。以上病例均行開放手術治療,參照Kojima等[1,2]提出B超預測膀胱重量方法:假設膀胱是一個球體,通過B超測量膀胱壁的厚度以及膀胱容量來測算出膀胱重量。術前行B超檢查估算膀胱重量并測量前列腺內外徑比值,術中提取膀胱逼尿肌組織標本2 cm×1 cm×1 cm備用。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 TRIZol(Invitrogen公司),RT-PCR試劑盒(德國QIAGEN公司),5×定量PCR buffer(美國ABI公司),dNTPs(25 mM)(上海生工),上游引物F(25 μ M)(達安基因),下游引物 R(25 μ M)(達安基因),dNTPs(10 mM)(Sigma公司),熒光探針(20 μ M)(達安基因)Taq酶(美國ABI公司)。結蛋白的上、下游引物分別為 :5′-GGAGAGGAGAGCCGGATCA-3′,5′-GGGCTGGTTTCTCGGAAGTT-3′, 探 針 為 5′-FAMTCTCCCCATCCAGACCTACTCTGCCC-TAMRA-3′;波形蛋白 的上、下游引物分別為:5′-ACACCCTGCAATCTTTCAGACA-3′,5′-GATTCCACTTTGCGTTCAAGGT-3′,探針為 5′-FAM-ATGTTGACAATGCGTCTCTGGCACGT-TAMRA-3′;肌球蛋白的上、下游引物分別為 :5′-TCGACGTCACGGGTTACATC-3′,5′-CGAATTGCCCGTGATTTTTC-3′,探 針為 5′-FAM-TGGGAGCCAACATTGAGACCTATCTGCT-TAMRA-3′;肌動蛋白分別為 :5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′,5′-TCTCCTTAATGT CACGCACGAT-3′,5′-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3′;轉化生長因子β1的上、下游引物分別為 :5′-CGAGCCTGAGGCCGACTAC-3′,5′-AGATTTCGTTGTGGGTTTCCA-3′,探 針 為 5′-FAM-CAAGGAGGTCACCCGCGTGC-TAMRA-3′。

1.2.2 儀器 紫外分光光度計(日本SHIMADZU UV mini1240),PE9600 PCR儀(美國 Perkin Elmer公司),熒光定量儀PE7000全自動熒光定量PCR儀(美國 Perkin Elmer公司)。

1.3 組織RNA的提取

組織塊(約100 mg)置勻漿器,加TRIZol(100 mg組織加TRIZol2 ml),冷凍勻漿,置Eppendorf管,靜置5 min,加入0.2 ml氯仿,蓋緊蓋子,用力搖動 15 s,靜置2-3 min,4℃12 000 r/min離心15 min,取上清液至新的Eppendorf管,加0.5ml異丙醇,靜置樣品10 min,4℃12,000 r/min(R=8 cm)離心10 min,棄上清液,1 ml 75%乙醇洗滌沉淀1次,4℃7,500 r/min(R=16 cm)離心5min,棄乙醇,空氣或真空干燥5-10 min,加焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)處理水溶解RNA,-80℃保存備用。

1.4 RNA樣品鑒定

濃度計算:每份樣品在紫外分光光度計上測定波長為260 nm時的吸光度值。濃度計算公式:濃度(g/L)=OD260×稀釋倍數×40÷1 000。

1.5 逆轉錄反應

取 5 μ lRNA模板做逆轉錄反應,儀器為PE9600PCR儀,反應體系如下:(德國QIAGEN公司RT-PCR試劑盒),5×逆轉錄 buffer 4 μ L;上游引物0.4 μ L;下游引物 0.4 μ L;dNTPs(25 mM)0.2 μ L;MMLV(10 U/μ L)1 μ L;DEPC 水 9 μ L;RNA 模板 5 μ L;總體積:20 μ L;反應條件 :37℃1 h,然后 95℃3 min 。

1.6 熒光定量PCR反應

用熒光定量儀PE 7000全自動熒光定量PCR儀檢測結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1 mRNA表達。樣本按以下反應體系進行 :5 ×定量 PCR buffer10 μ L;上游引物 F(25 μ M)1 μ L,下游引物 R(25 μ M)1 μ L,dNTPs(10 mM)0.5 μ L,熒光探針(20 μ M)1 μ L,Taq 酶 1.5 μ L,cDNA 5 μ L,ddH2O 30 μ L,總體積 :50 μ L,反應條件為:93 ℃2min,然后93℃45 s,55℃1 min,共 40循環。反應結束后,由電腦自動分析并計算結果。結果按B=拷貝數/μ LcDNA進行分析,考慮到各個樣本總RNA濃度的差異,最終計算結果按下列公式換算:A(拷貝數/μ g總 RNA)=B(拷貝數/μ LcDNA)÷ OD260×5÷6。

1.7 統計學方法

實驗指標的mRNA表達以拷貝數/μ g總RNA表示,組間比較采用非參數Mann-Whitney U檢驗,組內參數間相關性比較采用Pearson直線相關分析,應用SPSS V11.5統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 膀胱重量及前列腺內外徑比(見表1)

與對照組相比,BOO組膀胱重量明顯增加(P＜0.05);前列腺內外徑比顯著升高(P＜0.05)。

表1 膀胱重量與前列腺內外徑比關系(±s)

表1 膀胱重量與前列腺內外徑比關系(±s)

注:前列腺內外徑比例與膀胱重量的相關系數為:*r=0.521(P＜0.05),**r=-0.05(P＞0.05)

分組 例數 膀胱重量(g) 前列腺內外徑比BOO組 16 92.15±34.89 0.57±0.16*對照組 5 56.08±20.35 0.18±0.06**P值 0.017 0.001

2.2 逼尿肌中結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及TGF-β1mRNA的表達(見表2)

3 討論

BOO常導致逼尿肌功能改變,繼而產生一系列嚴重的并發癥如尿潴留、尿失禁及腎功能改變等,其中逼尿肌的收縮功能異常是BOO導致膀胱排尿功能障礙的主要原因[3]。BOO可使膀胱組織發生兩個變化,即早期逼尿肌的肥大和增生,后期膀胱壁的纖維化,纖維組織代替了逼尿肌組織。通過研究BOO后膀胱逼尿肌形態結構及其功能的變化,對指導BPH的治療有重要意義。Belenky等[4]提出多普勒超聲檢測膀胱逼尿肌血流阻力指數(RI)亦可作為診斷BOO的方法之一,結果顯示 BOO組在膀胱空虛和充盈狀態時逼尿肌 RI指數均高于非BOO組,表明BOO時逼尿肌血流減少。而膀胱逼尿肌的缺血可能是導致其超微結構改變的關鍵因素[5]。我們通過術前B超檢測顯示BOO組前列腺內外徑比例與膀胱重量之間有明顯相關性(P＜0.05),對照組無相關性;同時兩組間進行比較,BOO組中膀胱重量明顯增加(P＜0.05),前列腺內外徑比例也顯著升高(P＜0.05),提示BPH引起BOO后會導致膀胱重量明顯增加。而膀胱重量的增加是膀胱逼尿肌功能改變的重要原因。許多BOO動物實驗的結果提示我們,膀胱重量改變越明顯,離體逼尿肌收縮力受損害越大。說明BOO后膀胱重量的增加可能是膀胱功能失代償的重要標志之一。

表2 結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及 TGF-β1mRNA的表達(±s)(單位:×106拷貝數/μ g總RNA)

表2 結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及 TGF-β1mRNA的表達(±s)(單位:×106拷貝數/μ g總RNA)

注:與對照組相比,結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1mRNA的表達量差異具統計學意義(P值均＜0.01)

分組 例數 結蛋白 波形蛋白 肌球蛋白 肌動蛋白 TGF-β1 BOO 組 16 25.0±31.0 20.0±25.0 6.59±5.62 40.32±59.67 3.60±7.30對照組 5 2.4±2.1 2.2±0.9 0.60±0.56 2.63±1.36 0.18±0.13 P值 0.008 0.008 0.004 0.001 0.002

TGF-β是相對分子質量為25 000的雙肽鏈同聚體,包括TGF-β1 、TGF-β2、TGF-β3 和TGF-β1β2 四個亞型。在體內TGF-β1可能是以旁分泌形式作用于上皮細胞,TGF-β1是成纖維細胞和其他間葉細胞強有力的有絲分裂原,能刺激間質細胞生長,還能使堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)產生增加,而bFGF是間質細胞的自分泌刺激因子,能夠刺激逼尿肌的成纖維細胞增生,導致膀胱壁的增厚或纖維化。TGF-β1還具有調節細胞外基質成分如纖維連接蛋白、膠原的合成與降解的功能,導致細胞外基質的堆聚,從而增加細胞對生長因子的反應[6]。TGF-β1可促進受損傷的平滑肌細胞合成與分泌細胞外間質成分(如膠原纖維),抑制細胞外基質蛋白的降解,是影響器官纖維化最主要的細胞因子[7]。波形蛋白是中間絲的其中一種蛋白質。中間絲是真核生物細胞的重要結構性特征。它們與微管及肌動蛋白微細絲,組成細胞骨架。Tuxhorn等[8]研究發現TGF-β1誘導人前列腺癌細胞外基質組織中網狀蛋白、平滑肌α-肌動蛋白和膠原I的表達增加,間質呈肌成纖維細胞樣表現。結蛋白也是一種主要的中間絲蛋白。Malmqvist等[9]和 Berggren等[10]發現與正常對照組相比,BOO組逼尿肌中結蛋白/肌動蛋白比例明顯升高。

本研究結果顯示,與對照組相比,BOO組結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白及轉化生長因子β1 mRNA的表達量均有顯著增加。提示TGF-β1通過促進間質細胞或間質成分合成使細胞外基質成分(如結蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白等)改變、橋接作用增加,導致膀胱逼尿肌收縮障礙或不穩定,是逼尿肌在膀胱流出道梗阻后逐漸出現纖維化病變的重要分子學機制之一,其調控機理有待進一步深入研究。另外,我們認為 BOO后逼尿肌中肌動蛋白、肌球蛋白表達的增加以及肌動/球蛋白比例的上調可能是其收縮功能改變的分子基礎,通過及時解除BOO,有望阻斷膀胱逼尿肌的病變進程。但由于膀胱逼尿肌的收縮功能同時還受到其他相關因素的影響,如間質成分、生長因子、神經遞質等,具體的作用機制也有待進一步深入研究。

[1]Kojima M,Inui E,Ochiai A,et al.Ultrasonic estimation of bladderweight as a measure of bladder hypertrophy inmen with infravesical obstruction:a preliminary report[J].Urology,1996,47(6):942.

[2]Kojima M,Inui E,Ochiai A,et al.Noninvasive quantitative estimation of infravesical obstruction using ultrasonic measurement of bladder weight[J].J Urol,1997,157(2):476.

[3]William D,Steer S,William C.Effect of bladderoutlet obstruction onmicturition reflex pathways in the rats[J].J Urol,1988,140(4):864.

[4]Belenky A,Abarbanel Y,Cohen M,et al.Detrusor resistive index evaluated by Doppler ultrasonography as a potential indicator of bladder outlet obstruction[J].Urology,2003,62(4):647.

[5]Kessler TM,Gerber R,Burkhard FC,et al.Ultrasound assessment of detrusor thickness in men-can it predict bladder outlet obstruction and replace pressure flow study[J].J Urol,2006,175(6):2170.

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[7]Morrissey J,Guo G,Moridaira K,et al.Transforming growth factor-beta induces renal epithelial jagged-1 expression in fibrotic disease[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(6):1499.

[8]Tuxhorn JA,Arner GE,Smith MJ,et al.Reactive stroma in human prostate cancer:induction of myofibroblast phenotype and extracellular matrix remodeling[J].Clin Cancer Res,2002,8(9):2912.

[9]Malmqvist U,Arner A,Uvelius B.Cytoskeletal and contractile proteins in detrusor smooth muscle from bladders with outlet obstruction-a comparative study in rat and man[J].Scand J Urol Nephrol,1991,25(4):261.

[10]Berggren T,Uvelius B,Arner A.Denervation and outlet obstruction induce a net synthesis of contractile and cytoskeletal proteins in the urinary bladder of the male rat[J].Urol Res,1996,24(3):135.

The effect of bladder outlet obstruction on the expression of detrusor structural proteins and transforming growth factor-β1

WEI Xiao-bin,BAI Zhi-ming,LIU Zhen-xiang,et al.(Affiliated Haikou Hospital ofXiangya Medical College in CentralSouthUniversity,HaiKou570208,China)

ObjectiveTo investigate the change in expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mRNA following bladder outlet obstruction(BOO)in patients.MethodsFluorescent quantitation PCR was applied for detecting the mRNA expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 between 16 patients of BOO and 5 patientswith trauma as control group.ResultsThe bladder weights of BOO and control group were(92.15±34.89)g and(56.08±20.35)g respectively(P＜0.05);and the ratio of prostate exterior and interior diameter were(0.57±0.16)and(0.18±0.06),respectively(P＜0.05).The expression of desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mR NA were(2.4±2.1)×106、(2.2±0.9)×106、(0.60±0.56)×106、(2.63±1.36)×106and(0.18±0.13)×106copy number/μ g total RNA in control group respectively.When compared with control group,the expression of desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1mRNA were significant increase(P＜0.01)and were(25.0 ±31.0)×106、(20.0±25.0)×106、(6.59±5.62)×106、(40.32±59.67)×106and(3.60±7.30)×106copy number/μ g total RNA in BOO group respectively.ConclusionThe expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mRNA is closely correlatedwith detrusor function following BOO.

Detrusor;Bladder;Desmin;Vimentin;Myosin;Actin;Transforming growth factor-β1

R691.3

A

1007-4287(2010)09-1408-04

魏小斌(1972-),男,副主任技師,碩士,碩士生導師,檢驗科副主任。

2010-01-15)