難治性顳葉癲癇患者顳葉皮層 GRP78、caspase4的表達

劉功祿, 趙永波, 趙圣杰, 肖 倩, 沈 原

動物模型及臨床病理標本研究均表明,癲癇反復發作可導致腦內神經元凋亡[1,2]。死亡受體活化(外源性途徑)和線粒體損傷途徑(內源性途徑)是細胞內兩條經典的凋亡途徑,大多數對癲癇后引起的神經元凋亡的研究集中于這兩條途徑。內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)啟動的凋亡途徑是近年才發現的一種新的凋亡途徑。但 ERS在癲癇后腦損傷中的作用機制還遠未闡明。葡糖糖調節激酶(glucose regulated protein,GRP78)是內質網經典的標志分子,而 caspase4在人類 ERS反應性細胞凋亡途徑中具有關鍵性作用。為探討 ERS在癲癇腦損傷中的作用,我們采用免疫組化及 Western blot法分別檢測了難治性顳葉癲癇手術切除的顳葉皮層腦組織 GRP78、caspase4的表達。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 32例難治性顳葉癲癇患者均來自 2008.1～2009.1上海交通大學附屬仁濟醫院和上海曲陽醫院神經外科住院手術患者,其中男 19例,女 13例;年齡 6～41歲,平均 27.9±7.8歲;病程 4～32年,平均 13.5±7.5年;發作頻率 3～55次/m,平均 12.4±13.5次/m。患者都有癲癇的典型表現,發作類型符合國際抗癲癇聯盟 1981年有關癲癇發作分類的規定,并符合以下條件:(1)用 2種以上抗癲癇藥,正規治療 2年以上,與發作基線相比,發作無明顯減少;(2)頭部 CT或 MRI掃描除海馬硬化外無顱內占位性病變或其他神經系統疾病;(3)術前 24h頭皮腦電圖及術前 1w放置硬膜下電極皮層腦電圖監測,癲癇灶定位于一側的顳葉皮層和(或)海馬;(4)手術中沒有發現除癲癇外其他神經系統病變和可能引起癲癇發作的病因;(5)術后組織病理證實為神經元變性、膠質增生等非特異性改變;(6)患者及家屬術前簽署知情同意書。其中復雜部分性發作 22例,全身強直-陣攣發作 5例,復雜部分性發作繼發全身強直-陣攣發作發作 5例。對照組 15例,男 9例,女 8例,年齡構成與病例組接近,均無癲癇發作史及家族史。其中 5例為顳葉前中部腦血管畸形手術切除獲得的顳葉腦組織,15例為腦外傷顱內高壓減壓術術中采集顳葉腦組織,病理切片檢查未見組織異常,所有患者均簽署知情同意并且標本獲取得到醫院倫理委員會批準。

1.2 標本收集和保存 癲癇組和對照組患者顳葉皮層腦組織在術中采集,標本取出后部分立即放入液氮中,后放置在 -80℃低溫冰箱中保存備用,部分置于 4%多聚甲醛中固定 48h,隨后常規石蠟包埋切片,常溫保存備用。

1.3 免疫組化檢測 癲癇組和對照組腦組織常規石蠟包埋后(癲癇組,n=14;對照組,n=6),石蠟切片機行連續冠狀切片,片厚 5μm。每個標本隨機切 10片,然后每份隨機抽取 2片組成新待測樣本。采用 SP免疫組化法進行檢測(UltraSensitiveTM S-P免疫組化試劑盒,福州邁新生物技術有限公司),切片經脫蠟抗原熱修復,血清封閉液封閉后,滴加一抗 GRP78(兔單克隆抗體,1∶50,Cell Sigaling Technology公司)、Caspase4(兔多克隆抗體,1∶50,Abcam公司),4℃孵育過夜,然后滴加生物素標記的羊抗兔二抗室溫孵育 30min,DAB顯色,蘇木素復染,中性樹膠封片。用 PBS代替一抗作陰性對照。以胞質染成棕黃色為陽性。每張切片采用 AxioVision 3.1光學顯微鏡聯合 Axioplan 2顯微成像系統進行攝片(Carl Zeiss公司),應用 Imagepro-Plus圖像分析系統測定光密度(optical density,OD)值。

1.4 Western blot檢測 腦組織樣本(癲癇組,n=18,對照組,n=9)采用核-胞漿蛋白裂解液裂解蛋白,Bradford法蛋白定量。每泳道上樣 50μg,8%SDS-PAGE凝膠電泳分離后濕轉法電轉移至 PVDF膜。封閉后加入一抗(GRP78,1∶1000;Caspase4,1∶500)及內參照 GAPDH(鼠單克隆抗體,1∶2000),4℃孵育過夜后二抗室溫孵育 45min。ECL發光試劑反應 1min,暗室內 x線片曝光,顯影,定影。獲得的條帶膠片用 Acer掃描儀掃描,應用 Imagepro-Plus圖像分析系統測定 OD值,用同一標本內參 GAPDH的光密度值進行校正,按公式 OD相對值 =目的條帶表達強度/GAPDH表達強度,計算出相對值進行統計分析。

2 結 果

2.1 免疫組化結果 在對照組正常顳葉腦組織中僅見少量 GRP78陽性神經元,癲癇組 GRP78陽性神經元明顯增多,主要在神經元的胞漿內表達,經OD值比較,兩組間差異有統計學意義(t=15.464,P＜0.05)(見表1、圖1)。在對照組檢測到較弱 Caspase4表達,而癲癇組 caspase4免疫反應明顯增強,陽性神經元明顯增多,主要在神經元的胞漿內表達,經 OD值比較,兩組間差異有統計學意義(t=14.740,P＜0.05)(見表2、圖2)。

2.2 Western blot結果 對照組 GRP78、Caspase4蛋白條帶較弱,癲癇組 GRP78、Caspase4蛋白條帶較對照組明顯增強(見圖1、圖2),兩組兩種蛋白 OD相對值比較差異有統計學意義(GRP78,t=12.913,P＜0.05;Caspase4,t=9.956,P＜0.05)(見表3、表4)。

表1 GRP78蛋白免疫組化染色結果±s)

表1 GRP78蛋白免疫組化染色結果±s)

與對照組比較t=15.464,*P＜0.05

癲癇組對照組1460.767±0.077*0.242±0.031

表2 Caspase4蛋白免疫組化染色結果±s)

表2 Caspase4蛋白免疫組化染色結果±s)

與對照組比較t=14.740,*P＜0.05

癲癇組對照組1460.712±0.073*0.225±0.035

表3 GRP78 Western印跡結果±s)

表3 GRP78 Western印跡結果±s)

與對照組比較 t=12.913,*P＜0.05

癲癇組對照組1890.713±0.017*0.498±0.037

表4 Caspase4 western印跡結果±s)

表4 Caspase4 western印跡結果±s)

與對照組比較,t=9.956,*P＜0.05

癲癇組對照組1890.519±0.025*0.315±0.043

圖1 GRP78在難治性顳葉癲癇患者顳葉腦組織中的表達

圖2 Caspase-4在難治性顳葉癲癇患者顳葉腦組織中的表達

3 討 論

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是難治性癲癇中最常見的類型,約占難治性癲癇的 60%～70%。癲癇反復發作可導致腦內神經元凋亡和多種凋亡相關基因的表達[3]。

內質網(endoplasmic reticulum,ER)是哺乳細胞中一種重要的亞細胞器,也是重要的鈣離子貯存庫。它是調節蛋白質合成及合成后折疊、聚集的場所,是調節細胞的應激反應及細胞鈣水平的場所。在某些應激情況下,內質網的微環境發生改變,蛋白質的折疊受到影響,導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質堆積于內質網內,由此引起一系列分子伴侶(如GRP78)和折疊酶表達上調為標志的應答反應,稱為非折疊蛋白質反應(unfolded protein response,UPR),整個應激及其激發的應答過程稱為 ERS[4]。內質網通過激活 UPR以保護由 ERS所引起的細胞損傷,恢復細胞功能。然而 ERS持久或過度,就會誘導細胞損傷、凋亡[5]。癲癇發作導致機體氧耗增加、呼吸暫停和血管舒縮功能異常而繼發腦缺血、缺氧反應,誘導缺血缺氧性腦損傷。這種病理狀態下,GABA減少、神經元突觸后抑制作用減弱,NMDA受體通道開放增加,引起神經元興奮毒性損傷,而細胞膜去極化導致電壓依賴性 Ca2+通道開放,導致突觸前興奮性氨基酸釋放增加,其與突觸后相應受體結合后又導致細胞外 Ca2+內流,這一系列病理生理過程均可誘發內質網應激。Henshall等[6]認為癲癇的病理生理過程可以激活觸發 ERS,其誘導啟動的UPR保護性適應和損傷機制均參與了驚厥誘導神經元損傷過程,具體機制尚不清楚。

GRP78是存在于內質網上最多的應激蛋白,又稱葡萄糖調節蛋白,屬于熱休克蛋白家族。其主要功能是幫助新生多肽鏈的折疊、裝配和轉運,在缺血缺氧、鈣離子失衡、氧化應激等各種應激環境下,GRP78的表達量顯著增高,協助變性蛋白進行重新裝配和跨膜轉運,緩解內質網壓力。因此,GRP78被認為是內質網應激反應的標志性分子[7]。本研究檢測了頑固性顳葉癲癇患者癲癇灶內 GRP78的表達。免疫組化和 Western印記結果顯示癲癇組GRP78較對照組表達明顯增加(見表1、表3、圖1),提示癲癇反復發作誘發了內質網應激。GRP78通過促進蛋白質的正確折疊提高內質網的應激反應能力,在癲癇發作中起到保護神經元、對抗凋亡的作用。當這些機制不足以恢復內質網平衡時,細胞將啟動內質網相關的凋亡程序,清除不健康的細胞,所以 GRP78的表達反映了細胞的損傷情況和應激能力,對決定細胞的結局如抵抗、適應、損傷或凋亡等有重要作用。將來通過干預 GRP78的表達水平,有望成為癲癇發作后腦損傷的新的腦保護藥物,甚至成為治療頑固性癲癇新的藥物靶點。

Caspase-12作為 ER膜上的促凋亡分子,是 ERS介導的細胞凋亡關鍵分子,其活化是凋亡的中心環節,在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化。但caspase-12僅在某些嚙齒類哺乳動物中存在,在人類由于 caspase-12基因存在幾種突變子使其功能失活[8]。有學者發現,人類基因中的 caspase-4在人類ERS反應性凋亡途徑中起到 “caspase-12”的作用[9]。為了研究 caspase4是否參與了癲癇腦損傷,我們應用免疫組化和 Western印記技術檢測了頑固性顳葉癲癇患者癲癇灶腦組織 caspase-4的表達水平。結果顯示癲癇組 caspase-4表達水平明顯增加,Western印記還檢測到了 caspase-4的活化形式(cleaved)。因此,本研究提示 caspase-4可能通過內質網應激途徑介導了癲癇后神經元凋亡損傷,但其具體功能機制尚需進一步研究。caspase-4可能與caspase-12有類似的激活機制:內質網應激可能通過需鈣蛋白酶對原 caspase-4裂解或通過 GRP78/caspase-7復合物介導的機制而使 caspase-12激活。另外,腫瘤壞死因子受體相關因子 2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)能與caspase-4相互作用,切割 caspase-4使其活化。活化的 caspase-4進一步激活 caspase-9和 caspase-3,引起細胞凋亡。

本實驗結果提示難治性顳葉癲癇反復發作后誘發了內質網應激,表現為 GRP78表達增加,同時內質網特異性凋亡蛋白酶 caspase-4表達增加、活化,可能介導了癲癇后神經元凋亡損傷。但關于內質網應激在癲癇腦損傷中的作用機制研究還剛剛起步,還有許多問題亟待解決。隨著內質網應激在癲癇腦損傷及其發病機制中的深入研究,人們必將能找到有效的內質網應激誘導的細胞損傷,從而為癲癇的治療尋找新的途徑。

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