側腦室注射 Noggin對 AD小鼠海馬神經發生和學習記憶功能的影響

高長越, 范曉棠, 方傳勤, 王延江, 張莉莉, 李敬誠, 周華東

隨著人口老齡化,老年期癡呆越來越引起人們的關注。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年期癡呆中最常見的一種類型,臨床表現為不可逆進行性發展的記憶減退、認知下降、語言與人格障礙等。其特征性病理學改變為大腦皮層和海馬細胞內神經元纖維纏結(neuofibrillary tangle,NFT)、細胞外大量老年斑(senile plaque,SP)形成及神經元缺失[1]。目前在世界范圍內已成為引起老年人死亡的主要原因,全世界現有患病人數在 2千萬以上[2]。隨著我國人口老齡化問題的日益突出,對 AD的防治顯得非常迫切。到目前為止,AD在臨床上還缺乏有效的治療措施。

神經干細胞(Neural stem cell,NSCs)增殖、存活和分化的過程稱為神經發生(neurogenesis)。研究證明神經發生主要在哺乳動物腦內兩個區域——海馬齒狀回(subergranular zone,SGZ)、室管膜下區(suberventricular zone,SVZ)終生存在[3,4]。海馬齒狀回顆粒細胞更是在學習記憶機制中發揮重要作用。多項研究已表明 AD海馬神經發生減低與記憶功能減退有關[5]。AD重要的病理特征之一是神經元的丟失,因此促進內源性神經發生來替代治療AD是重要的臨床策略之一。既往的研究發現,Noggin在海馬錐體細胞及齒狀回顆粒細胞有高豐度表達,反義核酸抑制海馬內 Noggin表達后,可損害大鼠學習記憶能力,并降低海馬齒狀回神經增殖,提示Noggin對海馬神經元的存活和損傷修復可能具有重要意義[6]。為此我們以 12月齡 APP/PS1雙轉基因AD小鼠模型為基礎,觀察了在側腦室注射 Noggin后海馬神經發生的變化和學習記憶功能的改變,探討了 Noggin在 AD中的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 12月齡健康雄性 APPswe/PS1dE9轉基因 AD小鼠 20只,質量 32.2～43.1g,均源于美國 Jackson實驗室。BrdU、Noggin及抗鼠BrdU單克隆抗體購自 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 小鼠按拋硬幣法隨機分為生理鹽水對照組、Noggin注射組各 10只。注射組小鼠均經 3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后固定于江灣Ⅰ型立體定向儀上。按 Paxinos和 Watson立體定位圖譜,以前囪為零點,在前囪后 1.0mm、右側 1.5mm和 4.0mm深度置入不誘鋼管,導管外徑 0.5mm,內徑 0.3mm,用 502膠和牙托粉泥固定于顱骨表面,便于多次側腦室注射。

1.2.2 Noggin側腦室注射 Noggin注射組給予側腦室注射,微量注射的方法:右側腦室內導管插入術后,將外徑為 0.3mm的內套管插入該導管內,其末端比導管末端長 1mm,外端經一細塑料管 2μl微量注射器相連接,Noggin共 3μl(1μg/μl),以 0.5μl/min速度注入側腦室內,注射完畢停留 2min撥出內套管,每天注射 1次,共 7d。生理鹽水對照組僅給予 3μl生理鹽水注射。

1.2.3 Brd U腹腔注射及免疫熒光檢測 7d注射完畢后每組各取 4只小鼠給予BrdU腹腔注射,劑量 100mg/kg,注射時在動物房通風廚內進行,抓取小鼠時盡量輕柔,避免驚嚇等刺激,每天 2次,間隔 12h,連續 4d。均于最后 1次 BrdU注射后 5d殺死動物并灌注、取材,行冠狀冰凍切片,片厚 35μm,每隔 6張取 1張切片,取其中 1套(約 10張含海馬結構)進行免疫熒光染色并計數,累加后乘 6即為一側海馬齒回總的陽性細胞數。

新鮮配置 3%H2O2,室溫浸泡 5～10min以滅活內源性酶;4%布安液(4%甲醛/1%苦味酸/5%醋酸)固定 15min;2mol/L HCl浸泡 1h;0.1mol/L硼酸緩沖液中和 2min×3次,PBS洗滌 10min×3次,加封閉用血清,室溫 30min。滴加兔抗 Brdu一抗(1∶5000),恒溫下(4℃)孵育 24h;PBS沖洗 10min×3次,加入封閉緩沖液配制的二抗為[羊抗鼠 IgG1 Cy3(1∶500)],避光室溫 2h,避光條件下,0.01mol/L PBST洗滌 10min×3。避光條件下,貼片、避光、陰干、稀釋的甘油封片、4℃避光保存,1min內進行熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 AD小鼠的行為學檢測 7d注射完畢后注射組小鼠取出套管,局部碘伏消毒并縫合皮膚,各組余下 6只 Morris水迷宮進行行為學檢測。水池分為 4個象限,分別稱 SW、NW、SE、NE象限,在 NE象限正中放置一直徑 6cm的平臺,平臺頂低于水面0.5cm。實驗室內光線良好,水溫維持在(25℃ ±0.5℃),攝像機安置于水池上方 2.5m處,并與安裝有示蹤軟件的計算機相連。(1)定位航行實驗(place navigation test):實驗前 1d下午將小鼠放入水中自由游泳 2min,使其熟悉實驗環境。實驗歷時4d,每天上、下午兩個時間段,每個時間段訓練 4次。每次訓練隨機選擇一個入水點將小鼠面向池壁放入水池,記錄小鼠找到平臺的時間,即逃逸潛伏期(escape latency)。至 90s找不到平臺,即將其引上平臺,潛伏期記為 90s。每一時間段內 4次潛伏期的算術平均值作為這一時間段的學習成績。(2)空間探索實驗(spatial probe test):訓練 4d平臺實驗結束后,小鼠在籠中停留 2h。然后撤除平臺,進行空間探索實驗。將小鼠放至池中,記錄實驗小鼠在 60s內穿越平臺所在象限的次數,計算小鼠在平臺所在象限的游泳時間占總時間的百分比。

2 結 果

2.1 Noggin側腦室注射對 AD小鼠學習記憶的影響 將小鼠從 1d到 4d的訓練結果記錄下來,發現隨著訓練時間的延長,各組小鼠找到平臺的時間隨著訓練天數增加均有縮短,但下降的速率不一致,Noggin側腦室注射組小鼠平均逃逸潛伏期在每個時間段短于生理鹽水對照組(P＜0.05),我們觀察到各組小鼠中,隨著訓練時間延長,游泳速度有減慢的傾向,但同組每天以及組間彼此之間游泳速度相差均不明顯(P＞0.05),(見圖1)。空間探索實驗中,Noggin側腦室注射組在原平臺象限探索時間百分率明顯大于對照組小鼠(P＜0.05);對照組大鼠穿過原平臺位置次數也明顯少于 Noggin側腦室注射組(P＜0.05)(見表1)。

2.2 各組 AD小鼠海馬齒回 BrdU的檢測BrdU作為 DNA前體類似物替代摻入 S期細胞,活體注射而后利用抗 BrdU單克隆抗體,結合熒光標記顯示增殖細胞。本實驗可見 BrdU陽性細胞大都位于顆粒細胞層與門區之間,即所謂的顆粒細胞下層,往往緊密排列、成簇出現,細胞形狀不規則,多呈橢圓型或圓形。Noggin側腦室注射組小鼠 BrdU陽性細胞數(232.24±16.38)與對照組(125.21±16.32)比較明顯增加,差異非常顯著(P＜0.01)(見圖2)。

表1 撤除平臺后 60s內穿過原平臺位置次數及在原平臺象限探索時間百分比±s)

表1 撤除平臺后 60s內穿過原平臺位置次數及在原平臺象限探索時間百分比±s)

*P＜0.05

Noggin注射組對照組41.52±6.29%*32.32±4.80%4.02±0.65*3.51±0.31

圖1 Morris水迷宮檢測 Noggin側腦室注射及對照組 AD小鼠逃逸潛伏期、游泳速度

圖2 免疫熒光檢測兩組 AD小鼠海馬 BrdU陽性細胞數(箭頭所示,200×)

3 討 論

近年來神經干細胞(neural stem cells,NSCs)領域的迅速發展為包括 AD在內的神經系統變性疾病的替代治療打開了一個全新的研究方向。研究證明在哺乳動物腦內海馬齒狀回顆粒細胞下層(SGZ)神經干細胞能夠增生分化成為神經元并整合到復雜的神經環路中。在成年哺乳動物及人類的海馬齒回的NSCs的增殖、分化、遷移和整合因與記憶形成密切相關[5]。通過有效干預 AD腦內內源性的神經發生,從而達到對 AD相關的選擇性神經元丟失的治療有較好前景。有關 AD腦內神經發生的變化,多數體內和體外研究顯示 AD腦內神經發生下降[7～9]。其中 AD腦內神經發生下降構成了 AD病理生理機制的重要環節。因而如何促進 AD腦內海馬的神經發生在 AD防治領域具有重要意義。

Noggin與骨形成蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)是胚胎期神經發生的重要調控分子,在原腸胚期共同參與神經板和神經管的發生過程,其中 BMP4抑制分離的外胚層細胞向神經元分化,促進這些細胞向上皮細胞分化;而 Noggin作為BMP4的拮抗結合蛋白,與 BMP4的親和性較高,可阻滯 BMP4與其相應的受體結合,從而抑制 BMP受體信號通路,促進這些細胞向神經元分化[10]。目前已證明,Noggin不僅在胚胎期,在成年哺乳動物 CNS與外周神經系統的發育及神經發生起重要作用[11]。Noggin在成年大鼠 CNS內皮質、海馬、嗅皮質、小腦的蒲肯野細胞等部位的神經元均有一定水平的表達,但以前皮質與海馬表達水平最高,前皮質和海馬與學習記憶等腦的高級認知功能密切相關。以前研究發現,側腦室注射 Noggin反義寡核苷酸能抑制大鼠海馬齒狀回神經增殖,并且明顯抑制學習記憶能力[6],表明 Noggin的確與成年大鼠學習記憶相關。本實驗所選擇的 12月齡 AD小鼠相當于疾病的進展階段,我們通過向 AD小鼠側腦室注射 Noggin來觀察其對海馬神經發生和學習記憶的影響。本實驗中的Morris水迷宮是目前檢測實驗動物學習記憶水平最常用和重要的工具,是英國心理學家 Morris于20世紀 80年代初設計,并成為研究與海馬功能直接相關的空間學習記憶模型,是目前普遍使用檢測實驗動物學習記憶水平的重要工具。本實驗參照Yau、McNair等[12]的方法進行了改進,將測試次數、潛伏期作相應修改,來對小鼠進行行為學檢測。BrdU標記技術是目前研究神經發生應用最為廣泛的一項技術。非放射性標記物 5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)為胸腺嘧啶的衍生物,摻入 S期細胞,能與內源性胸腺嘧啶競爭摻入新合成的 DNA。活體注射或細胞培養加入,而后利用抗 BrdU單克隆抗體,ICC染色,顯示增殖細胞。本研究發現 AD小鼠在側腦室注射 Noggin較生理鹽水注射組學習記憶能力明顯改善。同時,用 BrdU標記海馬神經干細胞增殖中發現,AD小鼠在側腦室注射 Noggin較生理鹽水注射海馬神經干細胞增殖增加。本研究結果表明 Noggin可促進 AD小鼠海馬神經發生,并改善 AD小鼠的學習與記憶功能。Noggin對于 AD小鼠學習記憶能力的改善可能是與Noggin能促進海馬神經發生有關。我們既往研究證實[13],BMP4與 Noggin調控不同年齡段大鼠海馬的神經發生。Noggin基因亦是目前在體內與體外均被證實有神經誘導作用的神經誘導劑,并且分泌性Noggin蛋白與 BMPs有較高的親和力,因而干擾BMPs與相關受體的結合,因此其神經誘導作用也可能主要與拮抗 BMP2/BMP4的作用有關。

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