S-烯丙基別半胱氨酸對缺血 /再灌注大鼠神經細胞凋亡的影響

張 峰, 劉國平, 申 捷, 秦海軍

腦缺血是危害人類的重大疾病之一,在發達國家,致死率第三,致殘率第一[1],我國致死率上升至第一、二位[2]。目前除溶栓外尚無有效的治療方法。但是由于時間窗的限制,溶栓僅適用于小部分患者。因此尋找能夠有效緩解腦缺血損傷的藥物非常必要。腦缺血的過程中,凋亡是非常關鍵的環節,是遲發性神經細胞死亡的主要方式。線粒體功能的損傷在凋亡的過程中起著很重要的作用,目前認為,腦缺血后,缺氧缺糖,導致線粒體膜通透性的改變,引起大量離子內流,導致膜電位的喪失,同時 AIF和 Cytc釋放至細胞質中,引發凋亡[3]。S-烯丙基別半胱氨酸(SAC)具有抗炎、抗氧化等廣泛藥理作用[4],已有報道,它有較好的抗腦缺血的作用,具有抗氧化和抗凋亡的作用[5]。本實驗主要觀察其通過線粒體途徑的抗凋亡作用。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 SAC購自 Sigma公司,TUNNEL試劑盒購自海門碧云天生物試劑公司,AIF、Cytc以及 GAPDH一抗,HRP標記二抗均購自Abacm公司。

1.2 動物分組及給藥 30只雄性 SPF級別成年 SD大鼠,體重 220～250g,由復旦醫學院實驗動物中心提供。動物隨機分成 3組:假手術組(sham)、缺血 /再灌注組 (I/R)、SAC100組 (100mg/kg,ip)。缺血后 30min給藥。

1.3 模型制備 參照 Longa等的線栓改良法制備大鼠右側大腦MCAO局灶性腦缺血模型。大鼠用 10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸部正中切口,分離并暴露右側頸總動脈及頸內外動脈,結扎右側頸總動脈及頸外動脈根部,由頸總動脈近分叉處剪一小口插入尼龍線(長 50mm,直徑0.23mm在 18mm處作標記),插入長度約(18±0.5)mm感到有輕微阻力時停止,扎緊并固定線栓,縫合皮膚,阻斷血流 2h后,拔掉線栓實現再灌注。假手術組除不插線栓外,其余步驟同上,再灌注時間24h后處死,取皮質備用。

1.4 梗死體積測定 大鼠局灶性腦缺血后24h斷頭取腦,將腦置-20℃冰箱內 20min,去除嗅球、小腦后,沿冠狀平面每片約 3mm切 8刀片。然后迅速將腦片置于 5ml濃度為 1%的紅四氮唑溶液中,避光 37℃,溫孵 30min,其間每隔 7～8min翻動 1次,經染色后,正常腦組織呈玫瑰紅色,而梗死組織呈白色,照相用 imagetool3軟件計算缺血區體積。

1.5 AIF和 Cytc蛋白表達 從超低溫冰箱中取出凍存的皮質,經 RIPA液勻漿裂解后,12000r/mim離心 20min,棄沉淀,收集上清液用 Bradford法測定總蛋白含量.加樣蛋白含量 50μg經 10%SDSPAGE電泳分離,4℃條件下經 3～4h將蛋白電轉移PVDF膜,置膜于含 50g/L脫脂奶粉中(TBST緩沖液稀釋)封閉 1h,分別加入特異性兔抗鼠 AIF、Cytc Ab(1∶1000稀釋)、GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠多克隆抗體(1∶8000稀釋)進行免疫反應,以增強化學發光顯色系統顯色,ECL超敏曝光,以 GAPDH為內參。Image-pro5.0軟件分析灰度值。

1.6 線粒體膜電位檢測 rhodamine 123本身具有熒光,進入細胞后,可以選擇性地富集在線粒體上,線粒體內 rhodamine 123的量隨膜電位的變化而變化。通過測定線粒體 rhodamine 123熒光強度,反映膜電位及其變化。新鮮制備線粒體,各測定管先加入膜電位反應緩沖液 (蔗糖 15mmol/L,MgCl25mmol/L,琥珀酸鈉 5mmol/L,K2HPO4,Hepes20mmol/L,pH7.4)2.5ml,26μmol/L 40μl,然后加入 20μl線粒體蛋白混懸液,室溫下 10min,激發波長 503nm,發射波長 527nm,熒光酶標儀檢測,記錄數值,以熒光值的改變代表膜電位的改變。

1.7 TUNEL染色 將大鼠麻醉,開胸經升主動脈插管,依次灌注生理鹽水和 10g/L的甲醛各200ml,斷頭取腦,取缺血側前 1/2皮質置于同一甲醛溶液中固定 3d,石蠟包埋。面連續冠狀切片,片厚 4μm。采用碧云天公司凋亡檢測試劑盒染色。光鏡(400×)下觀察凋亡細胞數(個/高倍鏡下)。任意選取 3個高倍鏡視野,取平均值。

2 結 果

2.1 SAC對梗死體積的影響 模型組梗死體積為 25.33%±2.1%,SAC治療組能夠顯著降低MCAO引起的梗死(16.31%±1.8%,P)＜0.01)(見圖1)。

2.2 SAC對 AIF和 Cytc蛋白表達的影響 假手術組大鼠皮質均表達一定量的 AIF(0.32±0.02)、Cytc(0.30±0.01)蛋白,模型組大鼠表達量較正常組顯著增加(0.51±0.01,P＜0.01;0.54±0.05,p＜0.01),SAC治療組能夠顯著降低 MCAO引起的 AIF和 Cytc表達增高(0.35±0.03,P＜0.01;0.33±0.04,P＜0.01)(見圖2)。

2.3 SAC對線粒體膜電位的影響 SAC能夠顯著降低缺血再灌注所引起的 OD值下降,表明SAC能夠提高缺血再灌注引起的線粒體膜電位下降(見圖3)。

2.4 TUNNEL染色 假手術組僅有少量凋亡陽性細胞。缺血再灌注組出現極強的凋亡信號。SAC能夠顯著降低凋亡信號。隨機選取 3個高倍境視野(×200),計數 TUNEL染色陽性細胞數求平均值(見圖4)。

圖1 SAC對腦缺血再灌注引起的梗死體積的影響

圖2 SAC對 AIF和 Cytc蛋白表達的作用

圖3 SAC對缺血再灌注后膜電位的影響

圖4 SAC對腦缺血再灌注引起凋亡的影響

3 討 論

卒中引起的細胞死亡是由興奮性神經毒性、酸中毒、炎癥反應、氧化應激等復雜機制所引起,缺血時,血流完全阻斷的區域(即梗死中心區),迅速發生壞死;而由于周圍血管部分代償,梗死周圍神經細胞主要死亡方式是細胞凋亡。這一部分也是我們搶救的重點。尋找具有抗凋亡活性的藥物,并且確定其作用機制也顯得尤為重要。細胞凋亡激活途徑包括線粒體依賴的和非線粒體依賴的途徑。

線粒體是多種促細胞凋亡信號傳導分子的靶點,無論內源性途徑還是外源途徑都起著重要的作用[6]。在各種促細胞凋亡信號作用下,線粒體膜通透轉運孔不可逆性過渡開放,導致線粒體跨膜電位屏崩解,呼吸鏈解偶聯,線粒體基質滲透壓升高,內膜腫脹,位于線粒體膜間隙的 Cytc和 AIF及酶原等釋放于細胞質內,通過激活下游的 caspase啟動細胞凋亡[7]。Cytc在細胞凋亡過程中,從線粒體釋放進人胞質,與胞質中凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和 caspase-9相互作用,形成復合物,最終導致caspase酶活化[8]。AIF從線粒體轉位進人胞質和胞核,直接導致染色質凝聚和大片段降解,這些效應不依賴于 caspase酶[9]。線粒體通過不斷產生能量維持細胞存活,而通過釋放多種促凋亡分子啟動細胞凋亡過程,二者既相互聯系又相互矛盾,成為細胞死與活的調控中樞。已有文獻報道,SAC能夠通過抗氧化作用,和調節興奮性氨基酸的表達保護缺血性腦損傷[10]。在腫瘤方面,也有報道其能夠抑制正常細胞凋亡,促進腫瘤細胞凋亡[11]。本研究表明 SAC能夠通過保護線粒體,減少 AIF和 Cytc的釋放,從而起到抗凋亡的作用。至于對線粒體的保護,是直接的作用,還是抗氧化作用的間接途徑,還有待進一步研究。

總而言之,100mg/kg SAC缺血后 30min給藥能減少大鼠缺血再灌注后皮質神經細胞凋亡,這可能是通過減少 Cytc和 AIF蛋白從線粒體的釋放發揮作用。

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