腦梗死人群 NOS1基因多態性與脂代謝的相關性

高 鵬, 吳 江, 杜丹華, 李蘊博, 趙節緒, 胡林森

腦梗死是嚴重威脅人類健康的常見病,多發病,遺傳學研究表明腦梗死是一種多基因遺傳病,遺傳因素是其發病的一個重要因素[1];而高膽固醇血癥、吸煙、糖尿病和高血壓等是腦梗死的常見危險因素。

研究表明 ApoE基因敲除鼠表現出明顯的高膽固醇血癥和進行性的內皮功能障礙[2],高膽固醇血癥可降低 NOS1基因的表達[3]。Xie[4]等報道在敲除 ApoE基因誘導的高膽固醇血癥小鼠,血管內皮NOS1基因表達下調,進而血管內皮損傷。而 NOS1基因的表達上調可顯著改善高膽固醇血癥引發的動脈粥樣硬化癥(AS)[5]。

由此可見,NOS1基因與血管內皮功能和高膽固醇血癥的發生可能有關。我們前期研究發現NOS1基因多態性與腦梗死的發生有關[6],在此,本研究探討了腦梗死患者 NOS1基因多態性與脂代謝的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入 605例無血緣關系的腦梗死患者。樣本來自吉林大學第一醫院神經內科 2005年 ～2006年的住院患者,男 430例,女175例,平均年齡 60.1±11.7歲。由 2名神經科醫生根據詳細的神經科檢查、頭部 CT或頭部 MRI,并依據 TOAST分型標準[7]對腦梗死患者做出診斷,除外房顫、腫瘤等栓子來源的腦栓塞性疾病,除外肝腎功能不全,血液系統疾病。所有入組人群均簽署知情同意書,并采集全血用于 DNA提取。

1.2 方法 我們選擇了 rs9658281(SNP1,MspⅠsite)和 rs2682820(SNP2,HaeⅢ site)2個單核苷酸多態性位點,采用限制性酶切片段多態性的方法對 SNPs基因型進行分析。應用 DNA提取試劑盒(Promega,北京)提取基因組 DNA。應用 Primer 5.0軟件設引物,SNP1上游引物:5'-CAACCCTTAGCTTAAATCAG-3',下游引物 5'-GTGCCAGACCTAAGATGC-3';SNP2上游引物 5'-CCGAGGGT-AACTGGACATTG-3',下游引物 5'-CAAGGTAGGTGCTATAATCTC-3',由上海生物工程技術有限公司合成。PCR反應體系為 25μl,其中雙蒸水 18μl,10mmol Tris-HCl(pH 8.3),50mol KCl,1.5mmol MgCl2,4種dNTP各 200μmol,引物各 0.4μl,Taq DNA聚合酶(Promega,北京)1.0U,基因組 DNA 30 ～ 50ng。PCR反應條件:94℃預變性 5min,94℃變性 45s,55℃復性 1min,72℃延伸 1min,35個循環,最后72℃延伸 10min。酶切體系:PCR產物以限制性內切酶(Promega,北京)于 37℃水浴 4～6h酶切,經2%瓊脂糖凝膠電泳(90mV)40min,在凝膠成像系統(UVP,美國)下觀察結果。

1.3 統計學分析 應用擬和優度檢驗分析腦梗死患者基因型頻率的分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡;UNPHASED遺傳學軟件[8]Qtphase對近似正態分布的計量資料總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)進行數量性狀分析,應用 UNPHASED遺傳學軟件 cocaphase進行分析,P＜0.05認為有統計學意義。

2 結 果

2.1 SNP1和 SNP2位點雜合度分析及 Hardy-Weinberg平衡分析 SNP1經 PCR擴增及 MspⅠ酶切后,產生 GG、AG、AA等 3種基因型,基因型分布GG∶AG∶AA為 497∶100∶8,等位基因分布 A∶G為 116∶1094。 SNP2為 A/C二態 SNP,經 PCR擴增及 HaeIII酶切后產生 C/C、A/C及 A/A 3種基因型,基因型分布 CC∶AC∶AA為 230∶273∶102;等位基因分布 C∶A為 733∶477。擬和優度檢驗表明入組患者的基因型未偏離 H-W平衡(SNP1χ2=1.309,P=0.252;SNP2 χ2=1.846,P=0.174),說明我們選擇的樣本是隨機婚配的群體。

2.2 NOS1基因 SNP1和 SNP2位點的連鎖不平衡分析 應用 UNPHASED軟件對 SNP1和 SNP2位點進行連鎖不平衡分析顯示,SNP1和 SNP2不在同一個連鎖不平衡區。

2.3 SNP1和 SNP2位點多態性與 TC、TG、HDL-C、LDL-C、BMI的關系 NOS1基因 rs9658281的等位基因頻率與 TC明顯相關,攜帶 G等位基因個體的總膽固醇水平(TC)明顯高于攜帶 A等位基因的個體(χ2=4.583,P=0.032),而與 TG、HDL-C、LDL-C水平無明顯相關 (見表1);NOS1基因rs2682820的等位基因頻率與 TC與 TG、HDL-C、LDL-C水平無明顯相關(見表2)。

表1 SNP1位點多態性與血脂的數量性狀分析

表2 SNP2位點多態性與血脂的數量性狀分析

3 討 論

本研究應用數量性狀分析方法探討了腦梗死患者 NOS1基因多態性與血脂水平的相關性。腦梗死是多基因遺傳病,它的形成是由于多個微效基因變異的共同作用引起的,這些變異在群體中的分布是連續的,在不同個體間只有量的差異,而無質的不同,常稱這類性狀為數量性狀。因此對多基因遺傳疾病的某些連續性性狀進行數量性狀分析更符合疾病發生的本質。

NOS1基因定位于染色體的 12q24.2-q 24.31[9],全長 ＞240kb,包含 29個外顯子,編碼nNOS。最近的研究發現,在進化上古老的常見多態中即使是最輕微的有害變異也不會在人群進化中保存下來[10],許多與疾病相關的遺傳標記位于非編碼區或基因功能未知的區域[11～16]。因此我們選擇NOS1基因內含子上的 rs9658281和 rs2682820位點為遺傳標記。內含子是基因組中的一種重要調控元件,內含子可通過自身的剪接影響基因的表達,也可直接對基因的表達起調控作用[17],通過對內含子基因多態性的研究可能對疾病的發生提供線索。NOS1基因 5'-非編碼區存在選擇性剪切位點,不同的 mRNA剪切變體導致 NOS1基因在抑制動脈粥樣硬化(AS)新內膜形成及血管保護中作用的差異。我們在腦梗死患者的血漿總膽固醇水平與 SNP1位點的數量性狀分析中發現,攜帶 G等位基因個體的總膽固醇水平明顯高于攜帶 A等位基因的個體(χ2=4.583,P=0.032),證明 G等位基因與血漿增高的總膽固醇水平相關。因此我們推測攜帶 G等位基因人群的 mRNA剪切變體對高膽固醇血癥所致血管內皮損傷的保護作用較弱,從而更易引起 AS的發生,導致腦梗死。

此外,我們的研究人群來自于北方漢族人,這一研究結果還需要在不同地域、不同種族的人群中進行大樣本的重復來驗證。

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