狗棗獼猴桃葉提取物黃酮對(duì)大鼠急性腦缺血后caspase-3、VEGF表達(dá)的影響

賈明月, 陳嘉峰, 楊東娜, 王 靖, 金永日

大量研究已經(jīng)證實(shí),銀杏葉提取物銀杏黃酮因其具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、調(diào)整血液循環(huán)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用,被廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管疾病治療領(lǐng)域。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),狗棗獼猴桃葉[Actinidia kolomikta(Rupr.et Maxim)Planch.]亦含有與銀杏黃酮相類(lèi)似的物質(zhì)[1]。因此,我們開(kāi)展了對(duì)狗棗獼猴桃葉的化學(xué)成分以及藥效學(xué)等研究,從中提取分離了 9種黃酮類(lèi)化學(xué)成分,發(fā)現(xiàn)黃酮成分的主要結(jié)構(gòu)與銀杏葉提取物銀杏黃酮的結(jié)構(gòu)是極其相似的,并且狗棗獼猴桃葉總黃酮的組分遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于銀杏黃酮[2]?；诖搜芯?我們認(rèn)為狗棗獼猴桃葉提取物黃酮可能具有治療缺血性腦血管病的作用,有可能在某些方面與銀杏黃酮具有相同的藥理作用,我們就此開(kāi)展了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選用健康 Wistar雄性大鼠,鼠齡 6～8w,體重 240～280g由長(zhǎng)春市高新開(kāi)發(fā)區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為 4組,分別為:A鹽水對(duì)照組、B小劑量給藥組、C中劑量給藥組、D大劑量給藥組。B、C、D組于術(shù)前 30min以及術(shù)后 2h兩次分別給予狗棗獼猴桃葉提取物黃酮腹腔注射。B組(0.2%濃度 0.5ml/100g體重)、C組(0.4%濃度 0.5ml/100g體重)、D組(0.8%濃度 0.5ml/100g體重),A組則在相同時(shí)間給予腹腔注射生理鹽水(0.5ml/100g體重)。即 B組 =10mg/kg體重,C組=20mg/kg體重,D組 =40mg/kg體重。

1.2 主要藥物與試劑 狗棗獼猴桃葉提取物黃酮,由吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院藥物化學(xué)研究室提供,淡黃色粉末狀。TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒,由武漢博士德生物工程有限公司提供。Caspase-3免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;抗體用兔抗大鼠 Caspase-3抗體,購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;兔抗大鼠 VEGF多克隆抗體,購(gòu)于美國(guó) Santa cruz公司。

1.3 動(dòng)物模型制備 采用改良 Nagasawa方法制作線栓 MCAO模型。大鼠 10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉后,取頸正中切口切開(kāi)皮膚及皮下組織,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈,向上分離頸內(nèi)、外動(dòng)脈,在分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈根部,近心端距離分叉處1.5 cm處結(jié)扎頸總動(dòng)脈,用尼龍線穿過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈并向外側(cè)拉緊以阻斷血流。在頸總動(dòng)脈距離分叉處0.5cm處剪一小口,插入直徑為 0.234mm的斷端打磨得較光滑的尼龍線,事先在尼龍線的 1.8cm處用記號(hào)筆作標(biāo)記,待尼龍線通過(guò)分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈時(shí)放松穿過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈的尼龍線,使尼龍線進(jìn)一步進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,進(jìn)入長(zhǎng)度約 1.8cm±0.05cm,阻斷左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流,造成局灶性腦缺血。假手術(shù)組步驟同上,但尼龍線插入深度約為 1.2cm。

2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.1 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分 參考 Zea longa法對(duì)術(shù)后蘇醒的大鼠進(jìn)行功能評(píng)分:0分:無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)損傷體征;1分:不能完全伸展右側(cè)前爪;2分:行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:站立不穩(wěn),向右側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。功能評(píng)分 2分以上的為模型成功。如實(shí)驗(yàn)有死亡的鼠,則取同批次鼠補(bǔ)足,制成模型。

2.2 TUNEL染色制備及觀察 術(shù)后 24h后麻醉大鼠 打開(kāi)胸腔,暴露心臟,從左心室生理鹽水灌注,用 4%多聚甲醛 250ml灌注固定至四肢及頭尾逐漸僵硬。5min內(nèi)斷頭取大腦,放入新鮮配制 4%多聚甲醛中固定,從前到后每隔 2mm切 5片,取中間一片,常規(guī)乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。包埋后組織塊連續(xù)冠狀切片,片厚約 7μm,每個(gè)鼠腦取 1張切片進(jìn)行 TUNEL染色、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。在缺血側(cè)的大腦皮層及海馬區(qū)各隨機(jī)采集 5個(gè)高倍視野檢測(cè) TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞,取平均值。

2.3 原位雜交法檢測(cè) caspase-3的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟后嚴(yán)格按照 caspase-3免疫組化試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。胞漿被染成棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。應(yīng)用 Meta Morph顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定額頂葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞胞漿的灰度值,染色越深,其值越小,反應(yīng)胞漿內(nèi)蛋白表達(dá)量越高,每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野檢測(cè)灰度值和計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,取其平均值代表每只大鼠的陽(yáng)性表達(dá)程度。

2.4 免疫組化測(cè)定 VEGF的表達(dá) 上述方法石蠟包埋后組織塊連續(xù)冠狀切片,片厚約 5μm,用SP法進(jìn)行免疫組化染色,以胞漿棕色顆粒狀著色或核膜著色為陽(yáng)性細(xì)胞。在光鏡下以高倍鏡(20×10)對(duì)各組 VEGF反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算每張切片中 VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)非重疊視野,計(jì)算其平均值。

3 結(jié) 果

3.1 TUNEL染色 A組(鹽水對(duì)照組)缺血側(cè)大腦半球皮質(zhì)、海馬區(qū)、基底節(jié)區(qū)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞,缺血中心區(qū)呈散在分布,缺血區(qū)邊緣內(nèi)側(cè)成簇分布,陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈棕黃色,胞質(zhì)均質(zhì)濃縮,胞核深染,輪廓清晰,細(xì)胞體積小,邊集于核周呈新月形或環(huán)形,并且可以見(jiàn)到少量大小不等深染成棕黃色的圓形小體,形似凋亡小體。B、C、D組在缺血側(cè)缺血中心區(qū)和缺血周?chē)鷧^(qū)亦可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞,缺血中心區(qū)呈散在分布,凋亡細(xì)胞形態(tài)與 A組相似,但是數(shù)量顯著少于對(duì)照組(P＜0.05)。D組與 B組、C組比較凋亡細(xì)胞明顯減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表1、見(jiàn)圖1 ～圖4)。

表1 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目±s)

表1 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目±s)

與 A組比較*P＜0.05;與 D組比較△P＜0.05

組別 樣本數(shù)(n) 劑量(mg/kg) 凋亡細(xì)胞數(shù)(個(gè))ABCD 666610204020.73±2.2916.13±2.12*△14.30±1.52*△11.33±2.08*

3.2 caspase-3表達(dá) 顯微鏡下觀察到對(duì)照組和給藥各劑量組梗死側(cè)均有 caspase-3陽(yáng)性表達(dá)。主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體。caspase-3陽(yáng)性表達(dá)分布部位和檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞部位相對(duì)應(yīng)。給藥組(B、C、D組)與鹽水對(duì)照組(A組)相比較,局灶性腦缺血后 24h檢測(cè)灰度值增加,caspase-3 mRNA表達(dá)減弱,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組和 B、C組比較灰度值增加,caspase-3 mRNA表達(dá)減弱,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組和 C組之間沒(méi)有明顯差異 (見(jiàn)表2、見(jiàn)圖5～圖8)。

表2 Caspase-3蛋白表達(dá)的灰度值±s,n=6)

表2 Caspase-3蛋白表達(dá)的灰度值±s,n=6)

與 A組比較*P＜0.05;與 B、C組比較△P＜0.05

組別 樣本數(shù)(n)給藥劑量(mg/kg) 灰度值 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè))ABCD 666610204080.3±6.7140.6±3.5*162.4±6.1*246.2±4.3*△20.87±3.2815.50±3.57*12.40±3.37*7.50±1.73*△

3.3 VEGF的表達(dá) 觀察到對(duì)照組和給藥各劑量組均有 VEGF陽(yáng)性表達(dá),其主要分布于皮質(zhì)、海馬和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)。陽(yáng)性著染細(xì)胞主要為神經(jīng)元,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,表達(dá)于核周胞漿和主樹(shù)突,胞核為陰性表達(dá)。在脈絡(luò)叢的血管內(nèi)皮細(xì)胞為陽(yáng)性表達(dá),胞漿著染,胞核為陰性。鹽水對(duì)照組,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子陽(yáng)性著染神經(jīng)元數(shù)目增多,且在脈絡(luò)組織表達(dá)增高。藥物干預(yù)組,在缺血后24h神經(jīng)元及脈絡(luò)組織陽(yáng)性著染數(shù)目均高于對(duì)照組的表達(dá)數(shù)目。給藥各組與鹽水對(duì)照組相比,VEGF表達(dá)增強(qiáng),P＜0.05;根據(jù)均數(shù)大小,D組VEGF表達(dá)多于 B、C給藥組,P＜0.05(見(jiàn)表3、見(jiàn)圖9～圖 12)。

表3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目±s,n=6)

表3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目±s,n=6)

與 A組比較*P＜0.05;與 D組比較△P＜0.05

組別 樣本數(shù)(n)劑量(mg/kg)VEGF陽(yáng)性表達(dá)數(shù)(個(gè))ABCD 666610204020.73±2.2916.13±2.12*△14.30±1.52*△11.33±2.08*

4 討 論

局灶性腦缺血發(fā)生后神經(jīng)元的死亡包括壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)兩種方式,且兩者可以并存[3]。在缺血灶中心區(qū)域以壞死為主,而在缺血邊緣區(qū)則以凋亡為主。細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性死(programomed cell death,PCD),是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育,維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。凋亡是各種凋亡刺激信號(hào)始動(dòng),受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶類(lèi)和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等調(diào)控的“瀑布式”級(jí)聯(lián)激活過(guò)程[4]。細(xì)胞發(fā)生凋亡還是壞死由多種因素決定,包括損傷程度、Ca2+超載程度、細(xì)胞內(nèi) ATP水平以及 caspase-3激活程度。caspase家族在凋亡細(xì)胞的死亡中扮演了重要角色[5],作為蛋白酶與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),起最后樞紐作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合了分子生物學(xué)和形態(tài)特征,采用檢測(cè)靈敏較高的 TUNEL法原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡,免疫組化法檢測(cè) caspase-3各缺血部位的陽(yáng)性表達(dá)情況。證實(shí)了狗棗獼猴桃葉提取物黃酮可以降低大鼠腦缺血后梗死灶半暗區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目,并可通過(guò)抑制caspase-3的表達(dá)而抑制凋亡,從而起到保護(hù)腦缺血后神經(jīng)元的作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF),是在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中首先純化出來(lái)并命名的蛋白質(zhì),是一種具有高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原。VEGF能通過(guò)其受體特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,增加微血管通透性、誘導(dǎo)血管生成等多種功能[7,8]。其強(qiáng)大的促進(jìn)新血管形成的作用使其在梗死性血管病的治療中發(fā)揮巨大作用,在臨床上具有較好的應(yīng)用價(jià)值。腦血管閉塞以后,缺血區(qū)毛細(xì)血管增生,新生血管的形成來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有賴(lài)于VEGF的刺激。VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)起趨化和刺激作用,在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管生成。我們通過(guò)免疫組化的方法觀察了大鼠局灶性腦缺血 24h后 VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng),進(jìn)一步證實(shí)狗棗獼猴桃葉提取物黃酮可能通過(guò)腦缺血后增強(qiáng) VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。

通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)狗棗獼猴桃葉提取物黃酮可減少缺血后細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展,可促進(jìn) VEGF的表達(dá),對(duì)急性缺血性損傷后神經(jīng)元具有保護(hù)作用。由于本實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了腦缺血后急性期的研究,但能否通過(guò)促進(jìn) VEGF的表達(dá)來(lái)增加缺血后的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)新生血管的生成,有待進(jìn)一步研究。

圖1 鹽水對(duì)照組在缺血 24h后 TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞 40×

圖2小劑量組在缺血后 24h后 TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞 40×

圖3 中劑量組在缺血后 24h TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞 40×

圖4 大劑量組在缺血后 24h TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞 40×

圖5 鹽水對(duì)照組在缺血 24h檢測(cè)到caspase-3mRNA陽(yáng)性細(xì)胞 40×

圖6 小劑量組在缺血 24h檢測(cè)到 caspase-3mRNA陽(yáng)性細(xì)胞 40×

圖7 中劑量組在缺血 24h檢測(cè)到caspase-3mRNA陽(yáng)性細(xì)胞40×

圖8 大劑量組缺血 24h檢測(cè)到caspase-3mRNA陽(yáng)性細(xì)胞 40×

圖9 鹽水對(duì)照組在缺血 24h檢測(cè)到VEGF弱陽(yáng)性表達(dá) 200×

圖 10 小劑量組在缺血 24h檢測(cè)到 VEGF陽(yáng)性表達(dá)200×

圖 11 鹽水對(duì)照組在缺血 24h檢測(cè)到VEGF弱陽(yáng)性表達(dá)200×

圖 12 小劑量組在缺血 24h檢測(cè)到VEGF陽(yáng)性表達(dá) 200×

[1] 金永日,桂明玉,李緒文.狗棗獼猴桃葉化學(xué)成分研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2007,(11):2060-2064.

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