早期帕金森病大鼠線粒體損傷的研究

于德欽, 殷盛明, 彭 巖, 王冬梅, 王彥霞, 董方圓, 孫藝平,, 張萬琴

帕金森病(Parkinson's Disease,PD)是一種與年齡相關的中老年慢性神經系統變性疾病。PD早期發病時間長,有文獻報道可長達 10年之久[1]。其早期發病時間包括各種致病因素作用于機體并引起中腦黑質致密部多巴胺能神經元出現變性所需時間和中腦黑質致密部多巴胺能神經元進行性變性至 PD臨床癥狀出現所需時間。臨床尸檢資料發現只有當中腦黑質致密部多巴胺能神經元變性死亡達 50%,紋狀體內多巴胺水平降低至 70%～80%,患者才開始出現臨床癥狀[2]。

目前有關 PD發病機制的研究,多集中在 PD臨床期,PD早期發病機制尚不清楚,且相關的研究很少。這主要是由于臨床上很難收集到未出現臨床癥狀的又處于 PD無病期和臨床前期的病例,因此只能借助于采用早期 PD動物模型。將 6-OHDA注入腦內黑質紋體系統損毀大鼠多巴胺能神經元所制成的模型可以模擬早、中、晚各個時期 PD患者的病理改變[3,4]。有研究表明 6-OHDA注射入大鼠紋狀體將引起為期數周的黑質紋狀體系統緩慢的逆行性退行性變,使用小劑量單側紋狀體內注射法可建立 PD臨床前期動物模型[5,6]。本研究采用 6-OHDA制備早期 PD大鼠模型,觀察 PD發病早期大鼠中腦內神經元線粒體的超微結構改變及其抗氧化能力的改變。這將為 PD早期發病機制及 PD的早期防治提供線索。

1 對象與方法

1.1 研究對象 制備早期 PD動物模型,選用健康雄性 SD大鼠,體重 180～220克,用 4%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,門齒桿 3.4mm。根據 George Paxinos＆Charles Watson大鼠腦定位圖譜選取靶點,PD臨床前組注射靶點為紋狀體,坐標定位為 AP=+1.0,R=3.0mm(向右旁開),H=-4.5mm(硬膜下)。實驗動物腦內注射溶解于 Vehicle(0.1%抗壞血酸,0.9%NaCl)的 6-OHDA,20μg/3μl。 注射時 間約3min,留針 3min后慢慢退出。對照組動物在相同條件下,靶點內分別給以同等容積的 Vehicle。

1.2 電鏡技術 取上述各組 SD大鼠的 60μm厚冠狀腦片,用含有 2%多聚甲醛和 1.25%戊二醛的 0.1mol/L的鹽酸緩沖液固定。2%鋨酸后固定1h,常規 Epon812平板定位包埋。光鏡下選取特定組織,將其貼在預制的空白包埋塊上,超薄切片,鈾鉛雙染,透射電鏡觀察并攝片。每只動物隨機選取2個包埋塊制備超薄切片,每個包埋塊撈取 2張銅網,選用反差良好的一個銅網在電鏡下觀察,在放大100,000倍條件下,每張銅網選取 1個網眼,隨機在其上下左右 4個角度各攝片 1張,放大 20,000以進行形態學分析。觀察并比較中腦右側神經元內線粒體超微結構特點。

1.3 線粒體的分離 動物分別被斷頭取腦置于冰袋上,迅速取出腹側中腦黑質區腦組織塊,浸在緩沖液 A[250mmol/L甘露糖醇,0.5mmol/L EDTA,5mmol/L Hepes,0.1%(W/V)BSA pH7.4]中,剪碎。600×g,離心 5min,2次,去除細胞核及碎片。上清液在 10300×g,離心 10min。沉淀部分為線粒體粗制品。將沉淀部分懸浮于 5ml緩沖液 A中。分裝 4個含有 20ml 30%(v/v)Percoll[用 225mol/L甘露糖醇,1mmol/L EDTA,25mmol/L Hepes,0.1%(w/v)BSA(pH7.4)]配制離心管中,95000×g,離心 30min。收集底層褐黃色部分(線粒體)。

1.4 MAO-B活性測定 神經元內的 MAO-B主要位于線粒體(線粒體外膜),是線粒體的標志酶之一。制備線粒體,加入 40倍體積 50mol/L磷酸鈉緩沖液后于冰浴中漿化,用 Lowry法測定其蛋白量,進一步采用分光光度計法測定 MAO-B活性(按南京建成生物工程研究所試劑盒說明)。

1.5 SOD活性測定 用生理鹽水制備中腦勻漿,12500×g離心,取上清液,按南京建成生物公司試劑盒說明用黃嘌呤氧化酶法測 SOD活性,用 DTNB顯色法測 GSH-Px活性。

1.6 MDA含量測定 取腦勻漿上清液0.15 ml,用硫代巴比妥酸(TBA)法測脂質過氧化產物(MDA)含量。

2 結 果

2.1 線粒體電鏡結果 早期 PD動物中腦神經元內,大多數線粒體發生形態學改變,可見線粒體局部水腫,部分線粒體嵴排列紊亂、部分嵴消失及發生髓樣變性,另一部分線粒體膜融合破損(見圖1)(見圖中箭頭所示)。

圖1 給藥側黑質神經元超微結構的改變

圖2 中腦 MAO-B活性與同側對照組相比**P＜0.01

圖3 中腦 MDA活性與同側對照組相比**P＜0.01

圖4 中腦 SOD活性與同側對照組相比**P＜0.01

2.2 線粒體抗氧化活性

2.2.1 MAO-B與對照組相比,PD早期動物中腦神經元線粒體 MAO-B的酶活性明顯增高(見圖2)。

2.2.2 MDA與對照組相比,PD早期動物中腦神經元線粒體 MDA活性明顯增高(見圖3)。

2.2.3 SOD與對照組相比,PD早期動物中腦神經元線粒體 SOD活性明顯降低(見圖4)。

3 討 論

在 PD的發病過程中,有以下幾個階段:(1)無病期,此期僅有危險的致病因素存在。(2)臨床前期,此期 PD的病理過程開始,但無臨床癥狀,有臨床尸檢資料發現只有當中腦黑質致密部多巴胺能神經元變性脫失達 50%,紋狀體內多巴胺水平降低至70%～80%,患者才開始出現臨床癥狀[2]。因此 PD的早期發病可達幾十年之久[1]。(3)臨床期,此期PD的特征性的臨床癥狀己出現,從治療的角度出發,這已為時過晚。關于 PD治療,目前多采用 LDopa,但其不能阻止黑質內多巴胺能神經元的進行性變性,且使用后具有遠期不良效應。因此,對 PD早期發病機制的研究具有重要的社會意義。

PD的病因和發病機制至今不完全清楚,很可能是多種因素長期作用的結果,包括基因突變、接觸環境毒物(如魚藤酮、MPTP、6-OHDA等)、腦內炎癥反應和免疫功能失調等[7]。線粒體功能障礙參與 PD的發病已有很多研究,PD患者普遍存在著線粒體復合物 I活性下降和活性氧生成增加,這導致氧化應激和增加神經元對興奮性毒性死亡的易感性[8]。氧化應激與線粒體功能障礙還互為因果,惡性循環。SOD、MDA和 MAO-B均為線粒體內的常見酶。SOD為抗氧化酶,SOD可將 O2-·轉化為 H2O2,有效清除自由基。自由基的產生與清除失衡產生氧化應激作用,使線粒體 DNA發生氧化損傷。MDA為過氧化脂質的降解產物,生成過多的 MDA可誘導 Ca2+從線粒體、內質網釋放,導致胞內 Ca2+升高,誘發細胞凋亡。MAO-B可降解單胺類神經遞質,腦中的MAO-B活性隨年齡增加而升高,能使神經遞質高度氧化,導致腦組織中單胺類神經遞質的異常改變[9]。但是,線粒體氧化損傷是否參與早期 PD的發病機制尚未見報道。

本研究采用小劑量單側紋狀體內注射法建立PD臨床前期動物模型,經旋轉行為及邁步實驗檢測與對照組無明顯改變,證實為可靠的 PD臨床前動物模型。進一步研究發現,在 6-OHDA損毀側,PD臨床前期動物與對照組相比,PD早期腦內神經元的線粒體已出現超微結構的病理損傷,中腦的 SOD活性明顯降低,MDA及 MAO-B的酶活性明顯增高。提示線粒體的抗氧化能力降低可能參與早期 PD大鼠中腦神經元的損傷機制。這將為 PD的防治及抗PD藥物的研制開發提供重要的理論依據和線索。

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