甲強龍、電針聯合 AECs移植治療脊髓損傷的實驗研究

李一帆, 陳 東, 蘇 略, 薛 輝, 劉佳梅

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是人類致殘率最高的疾患之一,尤其是由于損傷常導致損傷平面以下運動和感覺功能的喪失,給家庭和社會帶來巨大經濟負擔。近年來的研究表明,羊膜上皮細胞可分泌多種神經營養因子,能促進神經元的存活及其軸突生長,在脊髓損傷的治療方面起著重要作用,使其逐步成為移植治療神經損傷較好的細胞來源。本實驗探討了甲強龍、電針與 AECs聯合治療對脊髓損傷后運動功能的恢復情況,為臨床脊髓損傷的綜合治療提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 大鼠 AECs的分離和培養 取妊娠中期(12～14d)Wistar大鼠,用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,在無菌條件下剝下胎膜內層的羊膜,收集AECs,加入含10%滅活的胎牛血清的 DMEM/F12培養液,以細胞數為 1×109個/L的密度接種到培養瓶中,置 37℃、5%CO2的細胞培養箱中靜置培養。

1.2 實驗動物及分組 60只體重 200～250g雌性健康的 Wistar大鼠,由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。隨機分為 5組,每組 12只。A組(SCI損傷對照):做 SCI手術,不進行治療;B組(甲強龍-MP治療):SCI后,立即靜脈推注甲強龍30mg/kg,4h后重復 1次,30mg/kg,此后,靜脈推注甲強龍 30mg/kg,2次/d,共 3d;C組(MP+電針):除了甲強龍治療外,SCI后 4h,行華佗夾脊穴電針治療。損傷平面上、下各 2對取穴,左、右穴位交替使用,選用長 25mm、直徑 0.35mm的毫針,上海產6805-II型治療儀,正 、負極 ,疏密波 ,頻率 1 ～2Hz,強度 0.3～1.0 mA,以針刺處肌肉輕微抖動為宜,持續15min,此后 1次/d,6d為 1療程,間隔 2d,進入下一個療程,共治療 3個療程;D組 (MP+電針 +AECs):在進行甲強龍和華佗夾脊穴電針治療的基礎上,SCI后第 7天,用微量注射器在脊髓損傷處移植 AECs 5μl,濃度 :1×107個 /μl;E組(假手術 ):只打開椎板,暴露脊髓,不造成 SCI。

1.3 模型制作及術后護理 所有器械經高壓蒸汽滅菌。用 10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g),用咬骨鉗和骨剪以開骨窗的方法去除 T10椎板,用自制改良的 Allen's撞擊器,以 60g·cm致傷力損傷大鼠 T10胸椎對應的脊髓(SCI)。術后開始每日腹腔注射青霉素 8萬 U/只,慶大霉素 0.2萬U/只,維持 7d。定時定量給以軟飼料喂養,飲水不加限制,人工排尿,直到自身排尿反射恢復。各組大鼠均飼養 30d后取材。大鼠共計死亡 2只,出現在A組術后 20d,解剖后發現死因為腸梗阻,隨后補充2只入實驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 免疫熒光組織化學觀察 每組取 6只大鼠,用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,生理鹽水、4%多聚甲醛常規灌流固定,暴露脊髓 T8～T12,迅速取出脊髓組織,4%多聚甲醛后固定 4h,梯度蔗糖脫水,OCT包埋,-70℃保存。用恒冷箱切片機做冠狀面切片,厚 16μm,切片經 10%羊血清封閉30min,5-HT一抗(兔抗大鼠,美國 Sigma公司 1∶100稀釋)4℃過夜,PBS沖洗;二抗(FITC標記羊抗兔,美國 Jackson Immunoresearch Labs 1∶200稀釋),室溫 1h,PBS沖洗,甘油明膠封片。每只動物隨機取 3張切片,于 200倍鏡下選擇脊髓損傷區中部的視野,顯微照片輸入計算機,用 Imagepro-plus(IPP)圖像分析軟件計數每張切片 5-HT陽性神經纖維的密度。

1.4.2 行為學觀察 參照 Basso等提出并改良的脊髓損傷大鼠功能恢復評判標準即 BBB評分法[1,2](共 21級),雙盲法對各組動物后肢運動能力進行評估,每隔 3d定時記錄大鼠雙后肢運動功能恢復情況。

1.4.3 神經電生理檢測 術后 30d,每組取剩余 6只大鼠,做運動誘發電位(MEP)檢測。將受檢大鼠用 10%水合氯醛作腹腔麻醉,在頭顱后部,消毒皮膚,切開頭顱后部皮膚,剝離骨膜,用牙科鉆在右側皮層中央后回感覺區相對應的冠狀縫后 3mm,矢狀縫旁 1mm處鉆一盲孔;左腿部剪毛,并暴露左腿坐骨神經。用 Powerlab誘發電位儀,BL-410生物機能實驗系統,刺激參數:粗電壓,強度 3V,波寬1ms,頻率 10 Hz,增益 20倍,濾波 300Hz,時間常數0.01s,掃描速度 6.25ms/div。刺激電極置于皮層,記錄電極位于坐骨神經,參考電極位于硬腭下。所有大鼠檢測完后測量其潛伏期和峰-峰值,進行統計學分析。

1.5 統計學分析 測量的各項數據用 SPSS 10.0統計軟件包進行方差分析,統計結果以均數 ±標準差±s)表示,檢驗標準 P＜0.01。

2 結 果

2.1 免疫熒光組織化學所見 在本實驗中,A組損傷區域內未見 5-HT陽性的運動神經纖維,B組偶見少量的呈綠色熒光的 5-HT陽性神經纖維,C組損傷區內可見少量、短小且無序的 5-HT陽性神經纖維,D組可見大量的 5-HT陽性的神經纖維通過損傷區,長度較 C組明顯增加,直徑粗細不等,且纖維走行方向較一致,幾乎平行排列,綠色熒光著色增強,E組 5-HT陽性的神經纖維繁多,較長,分布均勻,平行排列,規則有序。D組與 E組最為接近,與其它各組相比 5-HT陽性的神經纖維密度及長度,差異顯著(見表1、圖1)。

2.2 行為學變化 手術前所有實驗動物雙后肢 BBB評分均為 21分。A組大鼠脊髓受撞擊損傷后都出現雙后肢癱瘓,術后 1w內未見功能恢復,2w開始恢復,但恢復緩慢,到第 3周基本停止,只能恢復到后肢 3個關節的廣泛活動而不能持重行走。B組、C組和 D組在 SCI后經過治療,都有不同程度的后肢功能恢復,其中以 D組恢復最為明顯,最接近 E組。E組術后第 1天,后肢出現短暫性活動遲緩,第2天明顯恢復,1w后功能恢復接近正常。A組與其它各組比較均有明顯差異(見表2)。

2.3 神經電生理檢測結果 A組已經失去正常波形,經過不同治療的 B、C、D組與 A組相比較,MEP的峰-峰值都有明顯的增加,且潛伏期均有不同程度的縮短,其中以 D組效果最好,恢復程度最接近 E組。各組之間相比較,差異顯著,P＜0.01(見表3、圖2)。

表1 實驗各組大鼠脊髓損傷處 5-HT陽性神經纖維計數(n=6,±s/mm2)

表1 實驗各組大鼠脊髓損傷處 5-HT陽性神經纖維計數(n=6,±s/mm2)

與 B組比較*P＜0.01;與 C組比較△P＜0.01

A組B組 C組 D組 E組013.28±1.9775.56±19.42*158.39±25.39*△257.72±20.79*△

表2 實驗各組后肢運動功能的BBB評分比較(n=12,±s)

表2 實驗各組后肢運動功能的BBB評分比較(n=12,±s)

與 B組比較*P＜0.01;與 C組比較△P＜0.01

組別 3d 6d 9d 12d 15d 18d 21d 24d 27d 30d A組 B組 C組 D組 E組00.5±0.10.9±0.2*0.9±0.2*△9.4±0.4*△0.68±0.591.56±0.522.65±0.87*2.7±0.6*△19.6±0.8*△1.85±0.682.48±0.633.12±0.88*3.5±0.5*△20.1±0.8*△2.42±1.033.64±0.874.61±1.21*6.2±1.3*△20.9±0.1*△3.71±1.154.95±1.016.23±1.14*8.2±1.7*△21*△4.69±1.465.23±1.177.05±1.42*9.7±1.3*△21*△5.14±1.275.64±1.157.36±1.35*11.8±1.6*△21*△5.56±1.036.42±1.217.61±1.52*13.3±1.7*△21*△5.56±1.036.83±1.267.80±1.34*14.6±1.2*△21*△5.56±1.037.00±0.618.20±0.65*15.2±1.0*△21*△

表3 實驗各組 MEP-運動誘發電位潛伏期與峰-峰值比較(n=6,±s)

表3 實驗各組 MEP-運動誘發電位潛伏期與峰-峰值比較(n=6,±s)

與 B組比較*P＜0.01;與 C組比較△P＜0.01

A組B組 C組 D組 E組4.73±0.354.25±0.323.61±0.13*2.65±0.21*△2.01±0.02*△5.95±1.0315.40±2.9541.89±0.48*63.70±2.40*△80.76±0.53*△

圖 1A～E 實驗各組脊髓冠狀面,5-HT免疫熒光染色,示 5-HT陽性神經纖維(Bar=50μm)

圖2 實驗各組 MEP波形

3 討 論

1990年和 1992年Bracken等有關治療急性脊髓損傷的研究證實:只有應用大劑量的甲強龍(Methylprednisolone,MP)才能起到有效的神經保護作用 ,MP是一種人工合成的類固醇糖皮質激素,目前已廣泛應用于臨床脊髓損傷的治療[3]。針灸作為一種傳統的康復治療手段,在多年的臨床應用和實踐中取得了較好的療效[4～6]。針刺可以刺激中樞神經系統中內啡肽、復合胺、P物質、降鈣素基因相關肽、神經肽 Y等物質的釋放[7]。近年來有關 AECs在神經損傷后再生中的作用研究頗有報道。Davis等[8]發現羊膜基質的非細胞性提取物,在體內、外均能促進睫狀神經元軸突的再生,對在體成年大鼠海馬區的膽堿能神經元具有營養作用。Uchida等[9]利用人AECs條件培養基,體外培養 E18d大鼠神經元細胞系,研究顯示,培養基的神經營養作用來源于人AECs合成釋放的 BDNF、NT-3和 NGF,提示羊膜組織通過 AECs分泌釋放的 NTFs在胚胎神經發育的早期階段具有重要調節作用。孟曉婷等人的研究還表明大鼠 AECs也表達神經干細胞特征性抗原 Nestin以及 Musashi[10],提示 AECs與神經組織細胞具有一定的同源性與相似性,能夠很好的與神經組織整合,且 AECs具有低免疫原性,取材方便,不涉及倫理法律問題等,這些均為本實驗提供了理論依據。

5-羥色胺能神經纖維主要來源于腦干中縫核群,其下行投射系統主要投射到脊髓前角運動神經元,在前角以經典的突觸連接形式為主。下行到脊髓的5-HT陽性神經纖維,與運動信息傳遞有關。在本研究中D組即甲強龍、電針聯合大鼠 AECs移植治療脊髓損傷處 5-HT陽性的神經纖維數量明顯增多,與 E組即假手術組最為接近,且陽性纖維能夠長距離生長,并通過損傷區達到脊髓遠端,說明實驗中采用的聯合治療方法促進了 5-HT陽性神經纖維的再生,其機制推斷為 AECs與電針刺激通過直接或間接途徑使突觸末端的 5-HT遞質分泌增加并作用于脊髓前角運動神經元,部分恢復了上位中樞對脊髓遠端的調控,表現為 BBB評分提高,在 D組觀察到明顯的后肢運動功能恢復,可以達到持續爪掌支持行走,持續前后肢協調。1985年 Barker等人[11]發明無痛、非侵入性的經顱磁刺激技術之后,運動誘發電位 MEP廣泛用于臨床,側重于對脊髓損傷的診斷及預后評估。MEP是刺激中樞神經組織并在脊髓遠端、外周神經或肌肉記錄到的電信號,能直接檢測脊髓下行傳導束的功能狀態,同時在治療中判斷療效及預后特別是評估運動功能的恢復有著重要參考意義[12]。本研究中 D組 MEP峰-峰值和潛伏期雖沒有完全恢復到 E組程度,但是與其它治療組相比有顯著差異,具有統計學意義。

以上結果表明,甲強龍、電針與 AECs移植聯合治療脊髓損傷極大的促進了 5-羥色胺能神經纖維的再生,有效的恢復了 SCI大鼠后肢運動功能。本研究采用中西醫結合方法,應用我國傳統中醫針灸理論技術與現代細胞移植新技術相結合治療脊髓損傷,為脊髓損傷的治療提供了新的實驗依據。

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