乙酰谷酰胺對戊四氮致癇大鼠大腦病理改變以及GABABR和 NMDAR1的影響

孟 佳, 朱雨嵐, 張春媛, 王麗平

癲癇是多種病因引起的具有反復發作性質的慢性腦病。其發病機制復雜,人們從多個角度探索,并取得了一定的證實,包括:遺傳方面的研究、離子通道方面的研究、腦內氨基酸系統方面的研究等[1]。其中,氨基酸失衡學說是癲癇機制研究的熱點,人們對它的研究已進入了分子水平。

在我院兒科多宗病歷中,給腦癱患兒應用乙酰谷酰胺目的是保護腦組織,卻意外發現應用該藥的患兒癲癇發作頻率明顯減少,預后較好,這引起了我們的關注。乙酰谷酰胺在臨床上用于肝昏迷、偏癱、神經外科手術等引起的昏迷、癱瘓、及智力減退、記憶力障礙等,但是用于癲癇治療未見報道。為此我們做了以下探試性的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性 Wistar大鼠 50只,體重 180～220g,由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 隨機分為 4組,單籠飼養,第 1組為空白對照組(n=5);第 2組為模型組(n=15);第 3組為小劑量治療組(n=15);第 4組為大劑量治療組(n=15),后 3組設 3d、7d、14d組 3個時間點,每個時間點 5只。

1.2.2 模型與標本制作

1.2..1 模型制作 采用戊四氮(PTZ)點燃的驚厥模型,PTZ溶于生理鹽水中配成 1%的溶液,給予 1%PTZ75mg/kg腹腔注射,觀察大鼠行為變化。對照組給予同劑量生理鹽水腹腔注射。參考Racine分級法,點燃標準:所有大鼠均出現Ⅳ級或Ⅳ級以上的發作。

1.2.2.2 藥物治療 癲癇發作后立即給予乙酰谷酰胺腹腔注射,根據該藥的半數有效量(LD50)和半數致死量(ED50)以及人類和動物劑量換算關系得出,大劑量為 12μg/g;小劑量為 2μg/g;模型組和對照組給予生理鹽水。3d、7d、14d組分別給予治療 3d、7d、14d后經主動脈灌注,固定取材。

1.2.2.3 灌注與取材 最后一次藥物治療后4h后,用 10%水合氯醛麻醉動物,開胸暴露心臟,直視下將穿刺針經左心室刺入升主動脈,剪開右心耳將血放出,同時先用冷生理鹽水 200ml迅速灌注,再灌注 4%多聚甲醛直至看到由右心耳流出無色透明的液體。然后斷頭開顱取腦,將腦組織浸入 4%多聚甲醛于 4℃冰箱保存 48h。常規脫水、浸蠟、包埋,于海馬部位連續冠狀切片,行 HE染色(觀察大鼠海馬的神經元病理改變),及 GABABR和 NMDAR1免疫組織化學染色。

1.2.2.4 免疫組織化學方法 每只動物取 4張腦片,2張用于 GABABR;2張用于 NMDAR1,步驟如下:(1)烘烤;(2)脫蠟;(3)脫水;(4)沖洗;(5)修復;(6)冷卻;(7)沖洗;(8)阻斷;(9)沖洗;(10)次日分別加兔抗 GABABR多克隆抗體和 NMDAR1多克隆抗體,4℃冰箱過夜;(11)沖洗;(12)滴加山羊抗兔 IgG抗體;(13)沖洗;(14)滴加 DAB劑覆蓋組織室溫避光顯色 3～5min或更長時間,至顯色水終止反應;(15)沖洗;(16)復染;(17)脫水、脫二甲苯、封片。陽性著色為細胞漿棕黃色顆粒。

2 結 果

2.1 病理組織學改變

2.1.1 HE染色 空白對照組未見明顯改變。模型組:3d組鏡下可見大腦皮質輕度紅色神經元及神經元固縮,海馬錐體神經元固縮;7d組大腦及海馬錐體細胞彌漫性紅色神經元及神經元固縮,小腦蒲肯野細胞紅色神經元并進入顆粒層。14d組大腦皮質及海馬神經細胞減少,重度紅色神經元及神經元固縮,小腦蒲肯野細胞腫脹,紅色病變,進入顆粒層,基底節錐體神經元固縮,小血管血管壁增厚,血管周圍水腫及脫髓鞘病變(見圖1)。

治療組:病變嚴重程度,14d組 ＞7d組 ＞3d組。模型組、小劑量治療組、大劑量治療組 HE鏡下觀察,病變程度綜合比較,呈模型組 ＞小劑量治療組 ＞大劑量治療組趨勢,且大劑量治療組≈空白對照組。小劑量治療組:3d組鏡下可見大腦皮質及海馬紅色神經元及神經元固縮,病變程度與模型 3d組相似;小劑量治療 7d組,大腦皮質及海馬錐體細胞紅染,神經元固縮,其病變情況略輕于模型 3d組;小劑量治療 14d組大腦皮質及海馬神經元輕度紅染、固縮,細胞數量無減少。總體上,病變嚴重程度,14d組 ＞7d組 ＞3d組。大劑量治療組:3d組鏡下可見,大腦皮質及海馬神經元輕度紅染,固縮不明顯;大劑量治療 7d組,大腦皮質及海馬少量錐體細胞輕度紅染及固縮;大劑量治療 14d組,僅海馬少量錐體細胞輕度紅染、固縮,大部分基本正常(見圖2)?？傮w上,病變嚴重程度,14d組 ＞7d組 ＞3d組。

2.1.2 平均神經元壞死率 各組平均神經元壞死率的統計,即鏡下隨機選取 6個視野的神經元壞死率,計算平均值,采用兩因素析因方差分析,每組均 P＜0.05,得出結論:模型組、小劑量治療組、大劑量治療組 3組神經元壞死程度不同,3d組、7d組、14d組 3組神經元壞死程度不同,其中大劑量治療14d組神經元壞死率最低(見表1)。

2.2 免疫組化結果 海馬 CA1區 GABABR和NMDAR1表達顯微鏡下觀察各組 GABABR和NMDAR1的免疫組織化學表達結果,發現模型組、大劑量治療組、小劑量治療組的陽性細胞數分別明顯少于和多于空白對照組,而模型組、大劑量治療組、小劑量治療組之間相差不多。各組中的 3d組、7d組、14d組之間表達的陽性細胞數亦無明顯差異。以 GABABR和 NMDAR1陽性細胞數為指標,忽略3d組、7d組、14d組的分組,將所有指標分為模型組、大劑量治療組、小劑量治療組 3組,應用方差分析,得出 P﹥ 0.05,即模型組、大劑量治療組、小劑量治療組 3組間表達的陽性細胞數無顯著差異。

表1 平均神經元壞死率

圖1 模型 14d組海馬病理改變 HE染色 ×40

圖2 大劑量治療組 14d病理改變 染色 ×40

3 討 論

PTZ慢性點燃模型的動物一旦被點燃,其腦興奮性、易感性終身保持而且伴有自發性的驚厥發作。王藝等人在實驗中發現該模型能夠產生具有 EP特征的長期效應[2]。本實驗采用 PTZ誘導大鼠驚厥發作,出現急性癲癇的臨床表現,鏡下觀察腦組織呈現癲癇導致的神經原壞死等病理改變,因此用此模型模擬人類的癲癇、制造人類癲癇所致的腦損害模型,對臨床應用有指導意義。

既往研究發現,癲癇的發病機制之一是腦內興奮性氨基酸和抑制性氨基酸失衡學說,即中樞神經系統內抑制性神經遞質減少和興奮性神經遞質增多是癲癇發生的主要機制之一[3]。

由于乙酰谷酰胺通過血腦屏障后分解為谷氨酸和 γ-氨基丁酸,這讓我們大膽的設想乙酰谷酰胺的作用機制是通過促使腦內紊亂的氨基酸達到平衡,基于前期實驗的基礎[4],我們選取了 GABABR和NMDAR1,用免疫組化方法觀察、對比治療組與非治療組之間表達的變化,以平均陽性細胞數為統計指標,采用方差分析方法。本實驗主要目的在于:一方面,證實乙酰谷酰胺對驚厥導致大腦病變的治療作用;另一方面,尋找該藥的作用機制。

從大鼠 HE腦片的神經元壞死率指標看,治療組壞死率低于模型組,經兩因素析因方差分析得出結論模型組、小劑量治療組、大劑量治療組 3組大腦壞死程度不同,3d組、7d組、14d組 3組大腦壞死程度不同,其中大劑量治療 14d組神經元壞死率最低,由此可以證實該藥對驚厥導致的大腦病變具有治療作用,而且將各組神經元壞死率均數做對比,可以推斷在安全用藥前提下,乙酰谷酰胺的治療效果呈現一定的劑量和治療時間依賴性。

γ-氨基丁酸(GABA)作為中樞神經系統最主要的抑制性神經遞質,各類癲癇的發生幾乎都與腦內GABA的功能變化有關,通過抑制作用,其維持著神經元興奮與抑制的平衡,當該平衡被打斷,則 EP發作隨之發生[5～7]。孟紅梅等的實驗證明了下丘腦內轉染 GABA受體可以抑制癲癇的發作程度[8]。

GABA受體包括 GABAAR、GABABR、GABACR 3種類型。GABABR在突觸后膜,通過增加鉀離子傳導而產生的遲發性細胞膜超極化而抑制(IPSPs),對于抑制性神經信息傳遞的細胞調節具有重要作用;在突觸前膜,GABABR通過抑制電壓敏感性鈣離子通道而抑制 GABA或谷氨酸神經遞質的釋放,調節 GABA功能,促進或抑制癲癇發生發展[9～11]。

本實驗的研究結果顯示,模型組、大劑量治療組、小劑量治療組的 GABABR表達低于正常對照組,也可證實以上的結論,即癲癇的發生與 GAB-ABR的減少密切相關。NMDAR是興奮性氨基酸谷氨酸受體,是發現最早也是研究最多的一種受體,它主要分布于大腦皮層、海馬等部位,主要位于突出后膜。目前發現 NMDA受體至少存在 7個亞單位,其中 NMDAR1是該受體的功能單位。NMDAR介導的Ca2+細胞內流,引起的細胞內鈣超載,是導致癇性放電和擴散的重要基礎。因此興奮性氨基酸 NMDA受體活性及表達增高是神經元興奮性損傷及癲癇發病機制的關鍵環節。

動物研究實驗表明,NMDA受體拮抗劑有廣泛的抗癲癇譜,特別是對極量電休克癲癇和酒精撤退癲癇發作有效[12]。吳希如等人發現發育中 P77PMC大鼠腦內 NR1基因表達增高可能是造成 P77PMC大鼠/低驚厥閾值及對聽源性驚厥易感的原因之一,他們所做的另一實驗結果提示 NMDA受體活性增高是遺傳性癲癇易感大鼠產生驚厥的重要因素[13]。王贊[14]、王群[15]等分別用海人酸和馬桑內酯致癇大鼠觀察海馬各區的 NMDAR1mRNA表達的變化,得出NMDAR1mRNA表達的上調可能參與癲癇發生及癲癇易感性維持的分子機制。

我們的實驗結果也可以得出同樣結論,即癲癇的發生與 NMDAR1表達增多密切相關。本實驗通過免疫組化鏡下觀察,將治療組和模型組 GABABR和 NMDAR1的表達做比較,未發現有明顯的差異,為此我們推測,由于 GABABR和 NMDAR1具有多種亞型,每種亞型又具有多個亞單位結構,乙酰谷酰胺的作用途徑雖然不是通過 GABABR和 NMDAR1,但是有可能是通過受體的其他亞型起作用。因此有關乙酰谷酰胺的作用機制還有待于進一步研究,為癲癇的發病機制提供有力的證據,為癲癇的治療提供新的科學方案。

綜上所述,乙酰谷酰胺對癲癇有一定治療作用,并且在安全用藥前提下,乙酰谷酰胺的治療效果呈現一定的劑量和治療時間依賴性。但其作用機制可能不是通過 GABABR和 NMDAR1這兩個受體,有待進一步研究。

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