米諾環素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠凋亡相關蛋白表達的影響

周建波, 曾 麗, 梁 活

多發性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一種累及中樞神經系統白質,以炎性脫髓鞘為主要特征的神經系統疾病。本疾病因至今尚未完全清楚,一般認為是遺傳易感性與環境因素共同作用發生的自身免疫性疾病,近年來發現凋亡也可能參與其發病過程之中[1]。米諾環素是一種脂溶性較高的長效四環素,其組織穿透力強,口服吸收率高。眾多研究[2]指出,米諾環素具有廣泛神經保護作用,干預凋亡可能是其機制之一。

本研究通過對 MS經典動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠給予米諾環素進行預防性干預治療,并對疾病的發病率、發病后神經功能受損的嚴重程度、中樞神經組織病理變化情況、以及凋亡相關蛋白 Fas和 Bcl-2的表達等指標進行研究分析,探討米諾環素對 MS的作用和機制,為臨床實踐提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 選取健康豚鼠 20只,雌雄不限,體重 300～400克,用于制備抗原。健康純種遠交雌性 Wistar大鼠 50只,8～10周齡,體重180～220克。利用電腦產生隨機數字將大鼠分為 3組,分別為正常對照組 10只、EAE模型組 20只、米諾環素治療組 20只。以上動物均由廣西醫科大學動物中心提供。

1.2 EAE模型制備 將豚鼠用 10%水合氯醛按 0.5ml/100g麻醉后斷頭處死,在冰上剪開枕骨及椎管,剝離脊髓迅速取出,并將表面的脊髓膜和馬尾去掉,稱重,加入等重量 4℃的 0.9%生理鹽水,用勻漿機制成 50%的 GPSCH,再加入等量的完全弗式佐劑(CFA,Sigma公司),然后加入卡介苗(北京生物制品研究所)使每毫升含 5mg,混勻后制成油包水型乳劑,放入 4℃冰箱備用。

1.3 動物免疫及干預 將大鼠用 10%水合氯醛按 0.3ml/100g麻醉,模型組及米諾環素治療組每只大鼠雙后足墊和頸部皮下 3點共注射 0.5ml GPSCH-CFA;正常對照組在相同部位共注射 0.5ml的0.9%生理鹽水與 CFA混合劑(每毫升含卡介苗5mg)。免疫當天為 0d,待動物清醒后治療組按90mg/kg給予米諾環素(惠氏制藥有限公司)灌胃,從第 1天起按 45mg/kg進行灌胃;同時模型組和對照組給予相同劑量的 0.9%生理鹽水。

1.4 EAE模型成功標準 從免疫后當天起每日上下午兩次觀察大鼠行為學方面的變化,同時每天上午測一次體重并詳細記錄。評分標準[3]:0分:正常;1分:皮毛不光整,尾部無力;2分:尾部癱瘓;3分:尾部癱瘓加后肢無力;4分:尾部癱瘓加部分后肢癱瘓;5分:后肢完全癱瘓;6分:四肢癱瘓;7分:瀕死或死亡。

1.5 組織病理學觀察 正常對照組在免疫后第 21天統一處死,模型組和米諾環素治療組評分 1分以上的發病大鼠在發病后病情高峰時用 10%水合氯醛按 0.3ml/100g進行腹腔注射麻醉,先后用0.9%生理鹽水及 4%多聚甲醛常規灌注固定,取大腦、腦干、脊髓放在 4%多聚甲醛中固定 24h,然后逐級酒精脫水、包埋、切片,常規 HE染色,光鏡下觀察病理變化。

1.6 免疫組化 SP法檢測 Fas和 Bcl-2的表達。兔抗大鼠 Fas及 Bcl-2多克隆抗體為北京中衫金橋試劑,二抗山羊抗鼠兔 HRP(辣根過氧化物酶)廣譜檢測系統及 DAB顯色劑購自上海長島生物技術有限公司,其余試劑由廣西醫科大學實驗中心提供。將各部位標本經石蠟包埋后作 5μm連續切片,按免疫組化試劑盒說明進行操作,陰性對照用0.1 mmol/L的 PBS代替一抗。以細胞膜或胞漿黃色或棕黃色為陽性。所有大鼠大腦、腦干、脊髓各取 3張切片,每張切片取互不重疊的 5個視野。采用 Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析,分別計算各部位陽性細胞數(個/視野)及平均光密度(積分光密度 /面積,IOD/Area)。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 3組大鼠免疫后前 3d體重均下降。隨后對照組體重回升并持續增加,無大鼠發病;模型組免疫后第 13天開始發病,體重持續下降,發病后較發病前體重下降加快;米諾環素治療組免疫后第 14天開始發病,體重持續下降但較緩慢。各發病大鼠毛色晦暗,大小便失禁,四肢無力,部分行走困難。其中模型組大鼠發病 13只,米諾環素治療組發病 9只,兩組發病率相比(χ2=1.616,P=0.204),沒有統計學差異。兩組大鼠潛伏期治療組略長,但差異無統計學意義(t=1.617,P=0.122)。將各組動物的發病癥狀高峰時的評分值相加除以每組發病動物只數,得出平均值,比較各組動物發病的嚴重程度,結果模型組評分高于治療組(t=-2.58,P=0.018)(見表1)。

2.2 組織病理學改變 HE染色可見模型組和米諾環素治療組發病大鼠大腦、腦干、脊髓內小血管周圍有大量淋巴細胞浸潤,呈袖套樣改變。但米諾環素治療組明顯輕于模型組,炎性細胞浸潤以脊髓和腦干明顯,大腦較少(見圖1)。

2.3 Fas的表達 各部位細胞數比較,大腦和腦干模型組高于治療組,對照組最低(P＜0.05),脊髓模型組高于治療和對照組(P＜0.05)。各部位平均光密度值相比,腦干和脊髓模型組高于對照和治療組(P＜0.05),大腦模型組高于治療組,而對照組低于治療組(P＜0.05)(見表2、圖2)。

2.4 Bcl-2的表達 各部位細胞數比較,大腦和脊髓治療組高于模型組,而對照組低于模型組(P＜0.05),腦干模型組和治療組高于對照組(P＜0.05)。平均光密度值相比,各部位治療組高于模型組,而模型組高于對照組(P＜0.05)(見表3、圖3)。

表1 行為學觀察±s)

表1 行為學觀察±s)

與模型組相比較*P＞0.05,#P＜0.05

模型組治療組65%45%*15.62±1.8516.89±1.76*4.62±1.333.11±1.36#

表2 Fas蛋白的表達±s)

表2 Fas蛋白的表達±s)

與對照組相比較*P＜0.05;與模型組相比較#P＜0.05

對照組模型組治療組18.8±1.929.4±4.4﹡24.7±2.9*#20.8±2.332.1±4.3*26.3±3.9*#21.6±3.331.1±3.5*25.6±4.6#0.1268±0.01590.1851±0.0215*0.1581±0.0197*#0.1339±0.02750.1793±0.0128*0.1519±0.0243#0.1244±0.01420.1866±0.0259*0.1510±0.0282#

表3 Bcl-2蛋白的表達±s)

表3 Bcl-2蛋白的表達±s)

與對照組相比較 P＜0.05;與模型組相比較#P＜0.05

對照組模型組治療組18.6±2.223.7±3.7*27.9±3.3*#20.9±1.225.8±2.6*28.1±3.6*19.0±2.724.2±3.4*28.9±4.0*#0.1056±0.01830.1395±0.0271*0.1751±0.0245*#0.1160±0.02420.1422±0.0198*0.1674±0.0193*#0.1174±0.02590.1524±0.0263*0.1825±0.0192*#

3 討 論

本實驗研究結果表明模型組和對照組的各項指標相比均有顯著差異,說明 EAE大鼠凋亡相關蛋白的表達的確發生了變化;此外治療組和模型組間腦干和脊髓的細胞數及平均光密度也有顯著的差異,這也提示米諾環素對 Fas和 Bcl-2的表達起到了一定的干預作用。模型組大鼠發病高峰評分高于治療組,說明米諾環素治療可以適當緩解 EAE的病情;雖然兩組發病率相差 20%,但分析顯示差異無統計學意義,這有待增大樣本進一步驗證。

跨膜蛋白 Fas與其配體 FasL結合后激活靶細胞的固有死亡程序,而具有促凋亡作用。Gomes等[4]在復發緩解型 MS患者外周血單核細胞中發現 Fas表達增加,結果與本實驗相近;譚清華等[5]研究也證實 Fas的升高與 MS復發次數和病損程度正相關,是一個檢測復發的指標。致病性 T細胞凋亡消除被認為是 MS的管理機制之一,Okuda等[6]認為 T細胞對Fas介導細胞凋亡的抵抗導致 MS病情加劇。本實驗模型組中 Fas表達增加可能是大鼠機體的一種自我保護機制,以此促進致病性 T淋巴細胞的凋亡來緩和病情;和模型組相比治療組 Fas表達下降,可能是給予米諾環素后自身反應性淋巴細胞減少,從而使抗凋亡蛋白的表達也相應減少。

Bcl-2蛋白是重要的抗凋亡因子,它具有調控線粒體細胞色素 C釋放的功能,通過保護線粒體膜的完整性而發揮抗凋亡作用。本研究顯示模型組 Bcl-2上調,說明 EAE本身可以使抗凋亡蛋白增加而抑制凋亡,這也可能是大鼠機體的一種自我保護機制。而治療組的 Bcl-2蛋白高于模型組,這說明米諾環素治療使大鼠抗凋亡能力進一步增強。Sharief等[7]觀察到活動性 MS患者與穩定性 MS或其它對照比較,外周淋巴細胞中促和抗凋亡 Bcl-2成員的比率明顯降低,表明抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達增加或相對增加,此外國內有學者[8]發現米諾環素可以使癲癇大鼠海馬區的 Bcl-2蛋白表達增加,結果與本實驗數據相似。這種促和抗凋亡蛋白表達率的不平衡,減少了活動性MS對細胞凋亡的易感性,表明外周淋巴細胞 Bcl-2家族蛋白的表達失調是臨床活動性 MS的特征。此外有文獻報道[9]發現復發緩解型 MS患者B細胞內 Bcl-2蛋白明顯上調,認為復發型 MS患者中凋亡抑制蛋白的過表達,可能促進自身反應性 B淋巴細胞凋亡抵抗而潛在致病,因此導致持續自身免疫組織破壞。

Oren[10]等研究發現細胞凋亡與疾病嚴重程度相關,認為 MS患者體內凋亡和抗凋亡機制出現失衡,失衡的程度與疾病的進展密切相關。本實驗中模型組 Fas和 Bcl-2蛋白的表達均相對治療組升高,這可能都是大鼠機體的自我保護機制,但正是這種保護機制導致促與抗凋亡失衡,使病情進一步加劇。而治療組 Fas表達下調,Bcl-2的表達上調,表明米諾環素通過介導凋亡蛋白的表達以及抗炎作用致炎癥細胞減少,使細胞凋亡重新趨向平衡,也使免疫反應重新恢復正常,組織細胞損傷減輕,從而起到對疾病的治療作用。Das等[11]研究認為神經元死亡是誘導EAE后 8～10d細胞凋亡的結果,這發生在出現明顯的臨床癥狀前。由于臨床上MS的表現復雜多變,各種指標在每個病程中的表達可能不盡相同,而本研究的模型只是短期的急性病程,今后需要在其它病程模型中對凋亡相關蛋白的表達行進一步研究,并與自身反應性淋巴細胞的變化結合起來探索其具體的作用機制和變化規律。本研究提示米諾環素可以介導EAE中凋亡相關蛋白 Fas和 Bcl-2的表達,可能通過干預凋亡及減輕炎癥反應而間接調節免疫,對EAE起到了治療作用,這對于探討 MS發病機制和臨床治療提供了新的途徑和希望。

圖1 A:對照組;B:模型組;C:治療組(HE染色 ×400)

圖2 D:對照組;E:模型組:F治療組(Fas免疫組化染色 ×400)

圖3 G:對照組;H:模型組;I:治療組(Bcl-2免疫組化染色 ×400)

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