正交試驗優選乙肝寧顆粒的澄清工藝Δ

顏紅，夏新華，謝安，嚴建業，徐學云，朱麗，歐金秀，王艷平，熊飛燕（.湖南中醫藥大學藥學院，長沙市 4008；.湖南九芝堂股份有限公司，長沙市 40008）

·中藥工藝與制劑·

正交試驗優選乙肝寧顆粒的澄清工藝Δ

顏紅1＊，夏新華1#，謝安2，嚴建業1，徐學云2，朱麗2，歐金秀2，王艷平1，熊飛燕1（1.湖南中醫藥大學藥學院，長沙市 410208；2.湖南九芝堂股份有限公司，長沙市 410008）

目的：優選ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑用于乙肝寧顆粒的純化工藝。方法：采用正交試驗法對影響絮凝效果的主要因素進行優選，并與醇沉工藝進行比較。結果：采用ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝的芍藥苷保留率高，且可改善干膏粉的吸濕性。其最佳澄清條件為藥液濃度1∶7，攪拌速度350 r·min-1，80℃加入B組分0.4 mL·g-1，60℃再加入A組分0.2 mL·g-1。結論：ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝可用于乙肝寧顆粒的純化。

乙肝寧顆粒；ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑；ZTC1+1-Ⅲ型澄清劑；醇沉工藝；正交試驗

乙肝寧顆粒是由黃芪、白芍、茵陳、黨參、制何首烏、丹參、茯苓等13味中藥組成的復方，具有調氣健脾、清熱利膽、活血化瘀之功效。臨床上主要用于治療慢性遷延性及慢性活動性肝炎等癥。該制劑原生產工藝采用醇沉法除雜，但此工藝需要耗費大量的乙醇，成本較高，易造成有效成分的流失，且制得的干浸膏粉吸濕性較強。本試驗采用ZTC1+1天然澄清技術對乙肝寧顆粒的純化工藝進行研究，并以固形物保留率、芍藥苷保留率、干浸膏粉的吸濕性為評價指標，與醇沉法進行比較，為乙肝寧顆粒純化工藝的改進提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀、Waters 2487型紫外檢測器、Breez工作站（美國Waters公司）；UV-265型分光光度儀（日本島津公司）；800型離心沉淀器（長沙市科偉儀器廠）；DF101-S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-200320）；ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ天然澄清劑（天津漢威斯特科技開發有限公司）；乙肝寧水提濃縮液（湖南九芝堂股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 澄清劑的制備

2.1.1 ZTC1+1-Ⅱ澄清劑的制備取ZTC1+1-Ⅱ澄清劑A組分適量，先用少量蒸餾水攪成糊狀，然后加入需要量的蒸餾水，溶脹24 h，攪勻，即得1%A組分黏膠液。取澄清劑B組分適量，用少量1%醋酸溶解并攪成糊狀，加入足夠量的1%醋酸，溶脹24 h，攪勻，即得1%B組分黏膠液。

2.1.2 ZTC1+1-Ⅲ澄清劑的制備取ZTC1+1-Ⅲ澄清劑A、B組分，同“2.1.1”項下方法制備。

2.2 樣品溶液的測定

2.2.1 固形物保留率的測定分別取純化前、后的樣品溶液25 mL，置于干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，稱重，計算固形物保留率（固形物保留率＝純化后的固形物質量/純化前的固形物質量×100%）。

2.2.2 吸光度的測定取樣品溶液適量，以蒸餾水為空白，于720 nm波長處測定吸光度，即得。

2.2.3 芍藥苷含量的測定（1）色譜條件：色譜柱為Prodigy C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），檢測波長為230 nm，流速為1 mL·min-1，柱溫為室溫。理論塔板數按芍藥苷峰計算應＞3 000。（2）對照品溶液的制備與標準曲線的制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積積分值。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，芍藥苷進樣量（X）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝7.61×102X－9.88×103（r＝0.999 9）。結果表明，芍藥苷進樣量在0.20～1.00 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。（3）供試品溶液的制備與測定：精密量取樣品溶液適量，用0.45 μm微孔薄膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液適量，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑用于乙肝寧顆粒的澄清條件的優選[1～3]

2.3.1 澄清劑A、B二組分加入順序的確定經預試驗確定ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑的A、B二組分加入順序均為先加入B組分，后加入A組分。

2.3.2 澄清劑對水提液的純化處理取一定濃度的乙肝寧水提濃縮液100 mL，置于250 mL燒杯中，于磁力攪拌器上加熱恒溫至一定溫度，在一定攪拌速度下先加入一定量的B組分，每隔30 min攪拌1次，2 h后在一定溫度和攪拌速度下加入一定量A組分，再升高至一定溫度，保溫10～15 min，最后靜置30 min再攪拌1次。靜置6 h后取出，離心抽濾，得濾液。

2.3.3 單因素考察澄清劑加入量等因素對絮凝效果的影響

按“2.3.2”項下方法操作，通過單因素對比試驗考察澄清劑加入量、藥液濃度、溫度和攪拌對絮凝效果的影響。結果表明，ZTC1+1-Ⅱ澄清劑用于乙肝寧顆粒水提液澄清時，每1 g生藥量藥液中B組分加入量為0.4 mL，A組分加入量為0.2 mL時，沉淀為顆粒狀，濾液吸光度低；藥液濃度對絮凝工藝的影響顯著，當藥液濃度為1∶7時，沉淀完全，濾液吸光度低；A、B組分的加入溫度分別以80、60℃為宜；攪拌速度為350 r·min-1時，濾液吸光度低。ZTC1+1-Ⅲ澄清劑用于乙肝寧顆粒水提液澄清時，每1 g生藥量藥液中B組分加入量為0.6 mL，A組分加入量為0.3 mL時，沉淀為顆粒狀，濾液吸光度低；藥液濃度為1∶9時，濾液吸光度低，但考慮到1∶9時濃度太小，不適合生產應用，故藥液濃度可選擇1∶ 5；絮凝溫度為60、40℃，70、50℃時，濾液吸光度差別不大，故A、B組分的加入溫度以60、40℃為宜；攪拌速度為200 r·min-1時，濾液吸光度低。

2.3.4 正交試驗優選ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑絮凝澄清的最佳工藝在以上單因素試驗的基礎上，選擇藥液濃度（A）、攪拌速度（B）、澄清劑加入量（C）3個對絮凝澄清效果影響較大的因素作為正交試驗的考察因素，并以吸光度、固形物保留率及芍藥苷的含量作為評價指標，按L9（34）正交表安排試驗。ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝因素水平見表 1；正交試驗結果見表 2；方差分析結果見表3、表4、表5。

表1 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝因素水平Tab 1 Factors and levels of ZTC1+1-Ⅱclarification technology

表2 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝正交試驗結果Tab 2 Results of ZTC1+1-Ⅱclarification technology in orthogonal experiment

由表1～表5可知，影響澄清效果的因素大小依次為A＞B＞C；方差分析表明A、C對澄清效果均有顯著性影響，而B因素的影響則不顯著。結合前面單因素對比試驗結果，確定ZTC1+1-Ⅱ最佳澄清工藝條件為A2B2C2，即取濃度為1∶7的藥液，在80℃及350 r·min-1的攪拌條件下加入B組分0.4 mL· g-1，然后每隔30 min攪拌1次，2 h后在60℃及350 r·min-1的攪拌條件下加入A組分0.2 mL·g-1，攪拌10 min，升高溫度至80℃，保溫10 min，最后靜置30 min再攪拌1次，靜置6 h后離心抽濾，即得。

表3 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝吸光度方差分析結果Tab 3 Absorbance variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

表4 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝固形物保留率方差分析結果Tab 4 Solid retention variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝因素水平見表 6；正交試驗結果見表 7；方差分析結果見表8、表9、表10。

由表6～表10可知，影響澄清效果的因素大小依次為A＞B＞C；方差分析表明A因素對澄清效果有顯著性影響，而B、C因素的影響則不顯著。結合前面單因素對比試驗結果，確定ZTC1+1-Ⅲ最佳澄清工藝條件為A2B3C2或A2B2C2，即取濃度為1∶5的藥液，在60℃及200～250 r·min-1的攪拌條件下加入B組分0.6 mL·g-1，然后每隔30 min攪拌1次，2 h后在40℃及200～250 r·min-1的攪拌條件下加入A組分0.3 mL·g-1，攪拌20 min，升高溫度至80℃，保溫15 min，最后靜置30 min再攪拌1次，靜置6 h后離心抽濾，即得。

表5 ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝芍藥苷含量方差分析結果Tab 5 Paeoniflorin content variance analysis table of ZTC1+1-Ⅱorthogonal test

表6 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝因素水平Tab 6 Factors and levels of ZTC1+1-Ⅲclarification technology

2.4 ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ絮凝澄清工藝與醇沉工藝的比較

表7 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝正交試驗結果Tab 7 Results of ZTC1+1-Ⅲclarification technology in orthogonal experiment

表8 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝吸光度方差分析結果Tab 8 Absorbance variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

表9 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝固形物保留率方差分析結果Tab 9Solid retention variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

表10 ZTC1+1-Ⅲ澄清工藝芍藥苷含量方差分析結果Tab 10 Paeoniflorin content variance analysis table of ZTC1+1-Ⅲorthogonal test

2.4.1 醇沉處理液與ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+1-Ⅲ澄清劑處理液的制備取濃度為3∶1的乙肝寧濃縮液100 mL，加乙醇使含醇量達55%，攪勻，靜置24 h，濾過，得醇沉處理液。取濃度為1∶7的乙肝寧藥液280 mL（含生藥量40 g），加入B組分16 mL、A組分8 mL，按上述優選的工藝條件制備，濾過，得ZTC1+1-Ⅱ澄清劑的處理液。取濃度為1∶5的乙肝寧藥液200 mL（含生藥量40 g），加入B組分24 mL、A組分12 mL，按上述優選的工藝條件制備，濾過，得ZTC1+1-Ⅲ澄清劑的處理液。

2.4.2 固形物保留率、芍藥苷保留率的比較取以上3種純化工藝的處理液，按“2.2”項下方法進行測定。3種純化工藝的固形物保留率與芍藥苷保留率比較結果見表11。

2.4.3 干膏粉吸濕性的比較取上述3種純化工藝處理后的干浸膏粉適量，置五氧化二磷干燥器內干燥48 h至恒重。將底部盛有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器放入25℃的恒溫培養箱內恒溫24 h，此時干燥器內的相對濕度為75%。在已恒重的稱量瓶底部放入厚約2 mm的干膏粉，準確稱重后置于上述玻璃干燥器內（稱量瓶蓋打開）于25℃恒溫培養箱貯藏，定時（6、12、24、36、48、60、72 h）稱量，計算吸濕百分率。3種純化工藝的干膏粉吸濕曲線見圖1。

表113 種純化工藝的固形物保留率與芍藥苷保留率比較結果（n＝3）Tab11Comparisonofretentionrateofsolidsand paeoniflorin among 3 kinds of clarification technology（n＝3）

圖13 種純化工藝的干膏粉吸濕曲線Fig1Hygroscopic curves of powder of 3 kinds of clarification technology

3 討論

目前，絮凝澄清法替代傳統的醇沉法用于中藥制劑的純化工藝已有較多的研究報道。研究表明[4～6]，ZTC1+1絮凝澄清法具有生產安全、周期短、生產成本低、有效成分損失少等優點。

對乙肝寧顆粒澄清工藝的研究表明，ZTC1+1-Ⅱ、ZTC1+ 1-Ⅲ純化工藝的固形物保留率高于醇沉工藝，對主要有效成分芍藥苷的保留率及干浸膏粉的吸濕性方面均優于醇沉工藝，且以ZTC1+1-Ⅱ純化工藝為佳，表明ZTC1+1-Ⅱ澄清工藝可用于乙肝寧顆粒的純化。

[1]王亮亮，張黎明.ZTC澄清劑對黃姜總皂苷提取液的澄清工藝研究[J].天津科技大學學報，2006，21（4）：29.

[2]趙韶華，劉文娟，姚道魯，等.ZTC1+1天然澄清劑處理玉屏風口服液的工藝研究[J].時珍國醫國藥，2006，17（11）：2 239.

[3]張萍，吳月國，劉驊.ZTC1+1-Ⅱ澄清劑用于中藥水提液澄清[J].中國中藥雜志，2007，32（2）：113.

[4]王世宇，廖婉，付超美.Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑與大孔樹脂聯用在香菇多糖純化中的作用[J].中國藥房，2007，18（18）：1 381.

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[6]張三平.吸附澄清劑在中藥制劑中的應用研究[J].中國藥房，2008，19（6）：461.

Optimization of the Clarification Technology of Yiganning Granules by Orthogonal Experiment

YAN Hong，XIA Xin-hua，YAN Jian-ye，WANG Yan-ping，XIONG Fei-yan（School of Pharmacy，Hunan University of TCM，Changsha 410208，China）
XIE An，XU Xue-yun，ZHU Li，OU Jin-xiu（Hunan Jiuzhitang Co.，Ltd.，Changsha 410008，China）

OBJECTIVE：To optimize the clarification technology of Yiganning granules by ZTC1+1-Ⅱand ZTC1+1-Ⅲclearing agent.METHODS：Orthogonal experiment was applied to optimize the influence factors of flocculation effect and compared with alcohol precipitation technology.RESULTS：Retention rate of peoniflorin in ZTC1+1-Ⅱclarification technology was high and improve the hygroscopicity of powder.The optimal conditions were as follows：extracting solution concentration was 1∶7，the whisking speed was 350 r·min-1；0.4 mL·g-1B was added into solution at 80℃，then 0.2 mL·g-1A was added into solution at 60℃.CONCLUSION：ZTC1+1-Ⅱclarification technology can be used to purify Yiganning granules.

Yiganning granules；ZTC1+1-Ⅱclearing agent；ZTC1+1-Ⅲclearing agent；Alcohol precipitation technology；Orthogonal experiment

R 283；R97

A

1001-0408（2010）15-1364-04

2009-05-12

2009-10-25）

Δ國家科技攻關計劃課題（2001BA701A48）

＊講師。研究方向：中藥制劑新技術與新劑型。E-mail：yh-8632@126.com

＃通訊作者：教授，博士研究生導師。研究方向：中藥制劑新技術與新劑型。電話：0731-8458305。E-mail：xiaxinhua001@163.com