小鼠白細胞介素23基因在畢赤酵母中的誘導表達及初步活性研究

楊建嶺 姚智燕 楊藝紅魏 林 (河北醫(yī)科大學免疫學教研室,石家莊050017)

小鼠白細胞介素23基因在畢赤酵母中的誘導表達及初步活性研究

楊建嶺 姚智燕 楊藝紅①魏 林 (河北醫(yī)科大學免疫學教研室,石家莊050017)

目的:克隆小鼠白細胞介素23(mice interlecukin-23,mIL-23)基因,構(gòu)建高效穩(wěn)定的畢赤酵母表達菌株,并對得到的蛋白進行生物活性的初步測定。方法:采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術從pcDNA3-mIL-23上分別擴增獲得IL-23的兩亞基p19和p40,并通過重疊PCR(over-lap PCR)技術獲得含有連接子的p1940,構(gòu)建pPICZαA-IL-23重組質(zhì)粒;采用甲醇誘導畢赤酵母表達重組蛋白,MTT方法檢測誘導表達蛋白的促淋巴細胞增殖情況。結(jié)果:SDS-PAGE分析顯示在誘導24小時和36小時后的上清及24～96小時的沉淀中均可以檢測到約70 kD的誘導條帶。Western blot印跡法證實了重組蛋白為特異性蛋白。上清和沉淀中表達的重組蛋白IL-23能促進外周血單個核細胞的增殖,OD570 nm分別達到(0.235±0.029)和(0.216±0.035),而未刺激的對照組只有(0.135±0.008)和(0.164±0.017)。結(jié)論:成功構(gòu)建出mIL-23的酵母表達載體,誘導產(chǎn)生的蛋白可以明顯地促進外周血單個核細胞的增殖。

白細胞介素23;克隆表達;畢赤酵母;生物活性

白細胞介素23(IL-23)是近期發(fā)現(xiàn)的具有多種效應的促炎癥細胞因子之一,屬于 IL-12家族,由p19和p40兩個亞基組成[1]。IL-23是類似于 IL-6、IL-12的促炎因子,在Th0向Th17細胞的分化起始及維持Th17分化、發(fā)育中起關鍵性作用[2,3]。IL-23是由活化的Ⅰ型巨噬細胞和樹突狀細胞分泌,可以刺激記憶性T淋巴細胞的分化和增殖,也可以促進IL-17的釋放[1],還是連接固有免疫應答和適應性免疫應答的橋梁[4]。已有研究證實IL-23與類風濕性關節(jié)炎、腸炎、幽門桿菌引起的胃炎、牛皮癬等炎癥性疾病密切相關[5,6]。IL-23和IL-12部分地決定了免疫應答的走向是Th17還是Th1類型,越來越多的研究表明了IL-23在免疫系統(tǒng)中的重要作用[2,4,7]。

而目前尚無IL-23在酵母系統(tǒng)中的大量表達的報道。為了進一步研究IL-23的免疫學活性及其在Th17發(fā)育過程中的確切作用機制,本文通過基因工程的方法在畢赤酵母中表達出IL-23蛋白,并對其生物學活性進行了初步的研究,為深入研究IL-23在免疫應答網(wǎng)絡中扮演的角色和尋找治療慢性炎癥疾病靶位點奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌 E.coliDH5α、畢赤酵母X-33、質(zhì)粒pcDNA3-mIL-23、pPICZαA由本室保存。1.2 酶及主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、小提質(zhì)粒試劑盒、Taq DNA聚合酶及dNTP均購自TaKaRa公司,抗生素Zeocin購自Invitrogen公司;兔抗His的一抗和山羊抗兔IgG的熒光二抗為R&D產(chǎn)品,其它試劑皆為分析純。

1.7 mIL-23在畢赤酵母中的誘導表達 將陽性單克隆于25 ml BMGY中,28℃搖培16～18小時,至OD600 nm>2;4 000～5 600 r/min離心5分鐘,收集菌體棄上清,加100～150 ml BMMY稀釋至OD600 nm=1.0,于1 L培養(yǎng)瓶中繼續(xù)28℃搖培。分別在0、6、12、24、36、48小時時收集1 ml菌液,離心后上清與沉淀分別凍存。每隔24小時,補加100%甲醇至終濃度為5%,補加氨水至終濃度0.25%。

1.8 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western印跡分析上述上清30μl,加入2×SDS-PAGE上樣buffer(50 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L DTT,2%SDS,10%甘油)煮沸10分鐘,8 000 r/min離心5分鐘后,上清在10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳。而上述沉淀則需經(jīng)過裂解制備樣品,首先在菌體中加100μl的Breaking Buffer懸起,加等量的 acid-washed glass beads(0.5 mm),30秒渦旋,冰上30秒,重復8次;4℃最大轉(zhuǎn)速離心10分鐘,上清同前述進行SDS-PAGE。考馬斯亮蘭染色后,掃描電泳結(jié)果。此外,表達產(chǎn)物SDSPAGE后采用電轉(zhuǎn)印方法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上,NC膜置于含5%脫脂奶粉的PBST(封閉液,blocking buffer)中室溫封閉過夜;一抗為兔抗His的單克隆抗體(1∶1 000稀釋),室溫孵育1小時,PBST洗滌3～4次,10 min/次;二抗為熒光標記的山羊抗兔IgG,室溫孵育1小時,洗膜后在ODESSY上掃膜。

1.4 克隆構(gòu)建 分別以P19F/P19R、P40F/P40R為引物,質(zhì)粒pcDNA3-mIL-23為模板PCR擴增p19和p40。然后分別以p19和p40兩者的擴增產(chǎn)物為模板,以p19F/p40R為引物,over-lap PCR擴增p1940。p1940與載體pPICZαA同時經(jīng)XhoⅠ、NotⅠ酶切后,分別回收目的基因和載體片段并連接,T4 DNA連接酶4℃連接過夜,轉(zhuǎn)化DH5α,于含有25μg/ml Zeocin的LLB上涂板。挑取克隆,進行菌體PCR后挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒,應用XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定后測序。

1.5 電擊轉(zhuǎn)化酵母 使用 SacⅠ內(nèi)切酶線性化pPICZαA-mIL23,酶切產(chǎn)物電泳并膠回收純化,定量1 μg線性化的pPICZαA-mIL23加至含有100μl酵母感受態(tài)X-33的2 mm電轉(zhuǎn)杯中,電擊參數(shù):1.5 K V,25 μF,200歐姆,電擊后立即加入1 ml Sorbitol,轉(zhuǎn)入10 ml離心管,30℃靜置1小時后加入1 ml YPD,30℃, 200 r/min搖1小時,取50～200μl菌液涂于含有100 μg/ml Zeocin的YPDS平板。

1.6 酵母克隆的篩選鑒定 為篩選在AOX1位點同酵母菌發(fā)生重組的Mut+表型克隆。隨機挑取Zeocin+抗性克隆先后點在MM(1.34%Y NB 4×10-5%biotin 0.5%methanol)、MD(1.34%Y NB 4×10-5%biotin 2%dextrose)上,30℃培養(yǎng)2天。選擇在兩

2 結(jié)果

2.1 pPICZαA-mIL23表達載體的構(gòu)建篩選鑒定PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析,在分子量約為1 007 bp和591 bp位置可見清晰特異的條帶,分別與預期的p40和p19大小一致。將兩者混合后進行重疊PCR,產(chǎn)物進行電泳分析后,在分子量為約

1.6 kb的位置可見清晰條帶,與預期p1940大小一致。用XhoⅠ/NotⅠ分別將p1940和pPICZαA進行雙酶切消化,產(chǎn)物膠回收連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒。構(gòu)建成的pPICZαA/mIL-23酵母表達載體,進行菌體PCR擴增和XhoⅠ/NotⅠ雙酶切電泳分析,均可見大小約為1.6 kb的片段,進行SacⅠ單酶切后電泳分析可見大小為5.5 kb的片段,而SacⅠ單酶切消化pPICZαA后的電泳分析僅可見3.9 kb的片段。以上鑒定均表明成功構(gòu)建了重組載體pPICZαA/mIL-23,見圖1。

2.2 表達載體電轉(zhuǎn)化酵母后的克隆篩選與鑒定線性化的pPICZαA/mIL-23電擊轉(zhuǎn)化酵母菌X-33后,挑取Zeocin+抗性的克隆,進行Mut的表型篩選。表型為Mut+的克隆在兩塊板上都會有良好的生長,而表型為Muts的克隆僅能在MD板上正常生長,而在MM板上則生長很慢甚至或者就停止生長。以此判斷的克隆的Mut+克隆以P19F/P40R為引物進行菌體PCR。正確重組了mIL-23基因的酵母克隆能夠擴增獲得1.6 kb的片段,見圖2。

圖1 pPICZαA-mIL23表達載體的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of pPICZαA-mIL23

圖2 Mut的表型篩選及Mut+克隆的PCR鑒定Fig.2 Determining the Mut Phenotype and PCR identification of Mut+clones

圖3 重組質(zhì)粒工程菌表達 IL-23產(chǎn)物的 SDS-PAGE及Western blotFig.3 Analysis of IL-23 expression in engineered yeast by SDS-PAGEand Western blot

2.3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western blot 表達載體在BMMY和BMGY中通過甲醇和氨水誘導后,對各組樣品進行SDS-PAGE電泳:發(fā)現(xiàn)在24、36小時的上清中可以檢測到大小為70 kD左右的蛋白。同時,誘導了24、36小時的沉淀也可以檢測到誘導條帶,而空載體誘導后的上清及沉淀均未檢測到相同的誘導條帶。由于在表達載體pPICZαA上帶有his標簽,而Western免疫印跡表明表達產(chǎn)物與兔抗His的單克隆抗體有特異性結(jié)合,且對應了mIL-23加上α-factor及his的蛋白分子量大小,證實誘導表達獲得了預期的蛋白,見圖3。

圖4 誘導表達產(chǎn)物對外周血單個核細胞增殖的促進作用Fig.4 The promotion effect of induced products on the proliferation of PBMC

2.4 表達產(chǎn)物的生物活性測定 為了檢測誘導表達產(chǎn)物的生物學活性,我們應用MTT實驗檢測了其對PBMC的增殖影響。獲得的表達產(chǎn)物較明顯的刺激了PBMC的增殖,24、36小時的誘導上清及沉淀均使OD570 nm值達到0.216以上,而未誘導的對照組及空白組只有0.134,提示獲得的誘導產(chǎn)物mL-23具有其生物學活性,見圖4。

3 討論

作為一個在結(jié)構(gòu)和功能上同IL-12類似的免疫分子——IL-23,近期已經(jīng)成為細胞因子研究中的熱點。IL-23是一類異二聚體,由一個19 kD的α亞基和一個40 kD的β亞基共同折疊而成[1,2]。小鼠和人類IL-23p19亞基具有70%的同源性,并且與IL-12p35也具有很高的同源性。此外,IL-23和IL-12含有共同的p40亞基和受體 IL-12 Rβ1[2]。這說明 IL-23與IL-12在功能上有一定的相似性,但又不完全相同。在動物模型和人體上的實驗都表明了IL-23在起始和產(chǎn)生免疫應答方面起著重要作用。相反, IL-23的表達失控,會加劇炎性疾病的發(fā)生[8]。

具有生物活性的IL-23的合成,要求p40和p19是在同一細胞內(nèi)表達的[2,4]。再加上 IL-23的分子量(60 kD左右)較大,使得在真核系統(tǒng)內(nèi)表達IL-23變得較為困難。為了mIL-23在翻譯后較易折疊修飾成有活性的蛋白,本研究在p19和p40兩亞基間添加了5個中性氨基酸的連接子將其克隆至畢赤酵母表達載體pPICZα-A。此載體為高效的酵母融合表達載體,其N-端具有α-factor信號肽同時 C端有6×His標簽,使得所表達的蛋白可以分泌到胞外而且便于鑒定。因此我們獲得的mIL-23酵母表達菌株誘導后,在上清和沉淀中均有表達。我們的研究與文獻報道相一致,與對照組的空載體相比,克隆了mIL-23的實驗組明顯促進了PBMC的增殖,并證實了誘導后的產(chǎn)物具有生物學活性。而已有研究表明,IL-23是一類重要的炎性細胞因子,不僅參與Th1型免疫應答而且與Th0向Th17的分化及IL-17的分泌相關[3]。IL-23/IL-17軸線的免疫調(diào)節(jié)和IL-23在慢性炎癥疾病中的發(fā)生發(fā)展上都與IL-23密切相關[5,9]。因此,我們成功獲得的mIL-23表達菌株不僅為進一步研究其生物學活性及分子機制奠定基礎,而且為慢性炎癥疾病的治療提供了新的方法和途徑。

1 Beadling C,Slifka M K.Regulation of innate and adaptive immune responses by the related cytokines IL-12,IL-23,and IL-27[J].Arch Immunol Ther Exp,2006;54(1):15-24.

2 Van de Vosse E,Lichtenauer-Kaligis E G,van Dissel J Tet al.Genetic variations in the interleukin-12/interleukin-23 receptor(beta1)chain, and implications for IL-12 and IL-23 receptor structure and function[J]. Immunogenetics,2003;54(12):817-829.

3 McKenzie B S,Kastelein R A,Cua D J.Understanding the IL-23-IL-17 immune pathway[J].Trends Immunol,2006;27(1):17-23.

4 Langrish CL,McKenzie B S,Wilson N Jet al.IL-12 and IL-23:master regulators of innate and adaptive immunity[J].Immunnol Rev,2004;202: 96-105.

5 Caruso R,Pallone F,Monteleone G.Emerging role of IL-23/17 axis in H pyloriassociated pathology[J].World J Gastroenterol,2007;13(42): 5547-5551.

6 Hue S,Ahern P,Buonocore Set al.Interleukin-23 drives innate and T cell-mediated intestinal inflammation[J].J Exp Med,2006;203(11): 2473-2483.

7 Lankford C S,Frucht D M.A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity[J].J Leukoc Biol,2003;73(1):49-56.

8 Ghiladri N,K lajavin N,Chen Qet al.Compromisedhumoral and delayedtype hypersensitivity responses in IL-23 deficient mice[J].J Immunol, 2004;172(5):2827-2833.

9 K ikly K,LiuL,Na Set al.The IL-23/Th(17)axis:therapeutic targetsfor autoimmune inflammation[J].Curr Opin Immunol,2006;18(6):670-675.

[收稿2009-08-23 修回2009-11-04]

(編輯 倪 鵬)

Expression of mice interlecukin-23 in pichia and preliminary studies on its biology function

YANG Jian-Ling,YAO Zhi-Yan,YANG Yi-Hong,WEI Lin.Department of Immunology,Hebei Medical University,Shijia zhuang050017,China

Objective:T o clone the mice interleukin-23(mIL-23)and express it in Pichia efficiently.Methods:Two subunits of IL-23 were amplified by PCR from pcDNA3/mIL-23,and ligated together with adaptor by over-PCR.The IL-23 cDNA confirmed by sequencing was inserted into expressing vector pPICZαA and expressed inPichiaX-33 strain.IL-23 protein expression was induced by methanol and ammonia. The recombinant IL-23 was identified by immunoblot and its biological activity was analyzed.Results:DNA sequencing confirmed that cloned cDNA was identical to the published sequence of mIL-23.The recombinant plasmid pPICZαA/mIL-23 was electroprated into X-33.An expected 72 kD protein of mIL-23 wasfounded both in the induced pellets and supermatants by SDS-PAGE and coomassie blue staining.The 72 kD protein could be recognized in Western blot.While we could detect bands at 72 kD in cell pellets induced more than 24 h by Western blot.Detected by Western blot using anti-His antibody,we could see positive band at 72 kDfrom supernatants induced 24 and 36 h.While we could detect band at 72 kD in cell pellets induced between 24 h and 96 h.Meanwhile,we could see obviously proliferation of mice peripheral blood mononuclear cells(PBMC)treated with the induced pellets and supermanants.Conclusion:We have successfully expressed mIL-23 protein inPichia and the expressed product has its bioactivity in promoting the proliferation on PBMC.

IL-23;Gene clone and exprssion;Pichia;Bioactivity

R392.11 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)02-0120-04

①河北師范大學生命科學學院分子細胞研究室,石家莊050016

楊建嶺(1981年-),男,碩士,助教,主要從事感染免疫的研究,E-mail:yjianling@126.com;

及指導教師:魏 林(1961年-),女,教授,博士生導師,主要從事感染免疫學研究,E-mail:weilin21@ sina.com。