RP-HPLC法測定青海不同產地冬蟲夏草中核苷類成分的含量

李進，張文生，杜樹山，馮成強，倪雪梅（1.中藥資源保護與利用北京市重點實驗室，北京市100875；2.北京師范大學資源學院中藥資源與資源藥物研究所，北京市 100875）

冬蟲夏草又名蟲草、夏草冬蟲，是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體[1]，具有強腎、潤肺、益精氣、理諸虛百損等功效。近年來，人們用不同方法檢測冬蟲夏草的化學成分，其中重點是對核苷類成分的研究[2，3]，而《中國藥典》也將腺苷作為冬蟲夏草的質控指標。為了考察青海省內不同環境條件下冬蟲夏草的化學成分差異，筆者應用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，在相同色譜條件下測定了9個樣地冬蟲夏草中尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和蟲草素5種核苷類成分的含量。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀、2996型PDA檢測器、Mellennium32色譜工作站（美國Waters公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AX205型十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，水為純凈水；尿苷、肌苷、腺苷、蟲草素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為887-200202、140669-200401、879-200202、858-200202）；鳥苷對照品（美國Amresco公司，批號：0193，純度＞99%）；冬蟲夏草于2006年6月采自青海各地（見表1），由青海畜牧獸醫科學院李玉玲副教授鑒定為真品，新鮮樣品－20℃保存14個月后進行試驗，樣品保存在北京師范大學教育部資源藥物工程研究中心。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

表1 青海各地冬蟲夏草樣品統計Tab 1 The sample of C.sinensis from different parts of Qinghai province

色譜柱：Symmetry ShieldTMRp18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（梯度洗脫程序見表2）；流速：0.2～1.2 mL·min-1；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab 2 The gradient elution program of HPLC solvent

2.2 系統適用性試驗

按“2.1”項下色譜條件測定，計算柱效、分離度。結果表明，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素與其它組分的色譜峰分離度良好。系統適用性試驗測定結果見表3；色譜圖見圖1。

表3 系統適用性試驗測定結果Tab 3 Results of system suitability test

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液：分別取冬蟲夏草粉末（過60目篩）約0.3 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入20%甲醇10 mL后稱定質量，超聲提取40 min，取出，放冷，再稱定質量，用20%甲醇補足減失的質量，5 000 r·min-1離心15 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.2 對照品溶液：精密稱取尿苷對照品適量，加20%甲醇制成每5 mL含2.14 mg的溶液，作為尿苷對照品貯備液。同法制備每5 mL含2.06 mg蟲草素、2.03 mg腺苷、2.13 mg肌苷、2.01 mg鳥苷的對照品貯備液。取5種對照品貯備液各1 mL，制成對照品混合液，備用。

2.4 線性關系考察

精密量取對照品混合液3、5、7、10、13、15 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定5種對照品的色譜峰面積。以對照品進樣量（X）對相應峰面積積分值（Y）進行線性回歸，5種成分的回歸方程、相關系數與線性范圍見表4。

表4 5種成分的回歸方程、相關系數與線性范圍Tab 4 Regression equation，correlation coefficient and linear range of five components

2.5 精密度試驗

精密吸取5種對照品溶液各10 μL，重復進樣6次，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素峰面積積分值的RSD分別為2.10%、3.23%、4.29%、2.71%和2.82%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

對同一供試品溶液（編號9）在12 h內每隔1 h進行考察。結果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素峰面積積分值的RSD分別為1.04%，2.73%，3.69%，2.99%和1.91%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（編號9），共6份，分別按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定6次。結果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素含量的RSD分別為4.36%、3.66%、2.10%、3.29%與1.85%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批樣品（編號9）粗粉0.10 g，置于50 mL錐形瓶中，精密稱定，分別準確加入尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素對照品貯備液2 mL，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。結果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素的平均回收率（n＝6）分別為98.72%（RSD＝1.96%）、99.74%（RSD＝1.82%）、101.48%（RSD＝1.68%）、98.46%（RSD＝1.57%）、98.09%（RSD＝2.74%）。

2.9 樣品含量測定

取9批樣品，分別按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下，精密吸取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，測定；精密吸取尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素對照品貯備液各10 μL注入液相色譜儀，測定。以外標法計算樣品中5種核苷類成分的含量，結果見表5。

表5 9批樣品含量測定結果（mg·g-1）Tab 5 The content determination of 9 batches of samples（mg·g-1）

3 討論

本試驗在雷寧等[4]試驗方法的基礎上加以改進，能有效地對5種核苷類成分進行分離與鑒別，高效、靈敏、重復性好，能夠為今后冬蟲夏草核苷類成分的進一步研究提供很好的方法和依據。

含量測定結果表明，天然冬蟲夏草中的尿苷、鳥苷和肌苷含量較高，腺苷和蟲草素含量較低，與文獻報道[2，5]基本一致。而《中國藥典》將腺苷作為冬蟲夏草的唯一質控指標，不能完整確切地反映冬蟲夏草的質量，因此腺苷在冬蟲夏草質量控制中的應用還需要進一步研究。

通過將青海不同產地冬蟲夏草核苷類成分總量與海拔的關系進行初步比較，發現海拔在3 800～4 200 m之間的冬蟲夏草中核苷類成分含量較高，低于3 800 m或超過4 200 m的冬蟲夏草中核苷類成分含量較低。但核苷類成分與各個生態因子之間的相關性還需要進一步的研究證實。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：75.

[2]LI SP，LI P，ZHANG P，et al.The nucleosides contents and their variation in naturalCoryceps sinensisand culturedCordyceps mycelia[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2001，10（4）：175.

[3]汪 宇，于榮敏，汪曉寧.利用蟲草屬藥用真菌提取分離核苷類物質的研究進展[J].中國藥房，2004，15（1）：53.

[4]雷 寧，杜樹山，倪雪梅，等.RP-HPLC測定天然蟲草與人工蟲草中核苷類成分的含量[J].中國藥學雜志，2006，41（12）：948.

[5]侯曉蓉，欒連軍，程翼宇.冬蟲夏草中核苷類成分的毛細管區帶電泳定量分析研究[J].中國中藥雜志，2005，30（6）：447.