HPLC法測定蠶桑資源中1-脫氧野尻霉素的含量

陳巖，王智勇，楊一坤（.哈爾濱醫科大學第一附屬醫院藥學部，哈爾濱市5000；.哈爾濱醫科大學第二附屬醫院藥學部，哈爾濱市 5000）

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是天然存在的多羥基哌啶生物堿，化學名為（2R，3R，4R，5S）-2-（羥甲基）-3，4，5-三羥基哌啶。該化合物具有競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的藥理活性[1]，廣泛存在于蠶沙、桑白皮、桑枝、桑葉、桑椹等蠶桑資源中，可以防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥，同時可以提高糖耐量，預防和治療肥胖癥和高甘油三酯血癥，用于治療因碳水化合物代謝紊亂而引起的疾病。此外，還具有體外抗乙型肝炎病毒的作用[2，3]。

由于DNJ的結構中缺少生色團，無紫外吸收，目前多采用氣-質聯用（GC-MS）、液-質聯用（LC-MS）、高效液相色譜-熒光檢測器（HPLC-FLD）、高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）法進行含量測定[4～7]，對檢測儀器的要求高，給實際工作帶來不便。本試驗參考有關文獻[4]進行改進，采用熒光試劑芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）柱前衍生、高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）測定蠶桑資源中DNJ的含量，國內尚未見同類報道。

1 材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括510泵、717自動進樣器、996二極管陣列檢測器、柱溫箱、Millennium 2010色譜工作站（美國Waters公司）；AG-245型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；H-26F型離心機（日本Kokusan公司）；XJD-B微型高速粉碎機（姜堰市銀河儀器廠）；N-1000型旋轉蒸發儀、FD-5N型凍干機（日本Eyela公司）；KQ-200KDB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；EK-120A型電子分析天平（日本A&D Co.，LTD公司）。

1.2 試藥

DNJ標準品（純度＞99.2%）、熒光試劑FMOC-Cl均購自美國Sigma公司；蠶沙、桑白皮、桑葉均購自哈爾濱市老君堂藥店，經沈陽藥科大學孫啟時教授鑒定均為真品；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（50∶50）；檢測波長：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：25 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準品溶液：精密稱取DNJ標準品1.0 mg，加水溶解并定容至10 mL，即得，備用。

2.2.2 藥材提取液：參考有關文獻[4]中藥材提取液的制備方法。精密稱取各藥材粉末1.0 g，加25 mL 0.05 mol·L-1HCl超聲波提取30 min，上清液轉移至50 mL量瓶中，殘渣加20 mL 0.05 mol·L-1HCl超聲波提取30 min，合并上清液，加0.05 mol·L-1HCl定容，搖勻，得各藥材提取液，備用。

2.3 柱前衍生化處理

2.3.1 衍生化反應原理[4]：20℃下，DNJ和過量的熒光試劑FMOC-Cl在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液中反應20 min，生成熒光產物DNJ-FMOC。

2.3.2 藥材供試液的制備：精密吸取各藥材提取液0.2 mL，置于1.5 mL離心管中，分別依次加入0.2 mL硼酸鹽緩沖液（pH 8.5）、0.1 mL 10 mmol·L-1FMOC-Cl的乙腈溶液，立即混勻，20℃反應20 min，加入0.5 mL 0.1%冰醋酸水溶液，混勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得各藥材供試液。

2.3.3 空白供試液的制備：取重蒸水0.2 mL，按“2.3.2”項下方法制備空白供試液。

2.4 線性關系考察

精密吸取DNJ標準品溶液5、10、25、50、100 μL，分別依次加入 0.2 mL硼酸鹽緩沖液（pH 8.5）、0.1 mL 10 mmol·L-1FMOC-Cl的乙腈溶液，立即混勻，20℃反應20 min，加入0.1%冰醋酸水溶液補足至1.0 mL，混勻，0.45μm微孔濾膜濾過，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以DNJ濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝47 800 312X－6 875（r＝0.999 9）。結果表明，DNJ的檢測濃度在5.0×10-4～1.0×10-3mg·mL-1范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。檢測限為1.0×10-4mg·mL-1（P/N＞3）。

2.5 精密度試驗

取衍生化的DNJ標準品溶液（濃度為5.0×10-3mg·mL-1），按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次。結果，RSD＝1.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取桑白皮藥材供試液，于配制后2、4、6、8 h進樣，按“2.1”項下色譜條件測定DNJ含量。結果，RSD＝1.8%，表明藥材供試液在8 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批桑白皮樣品，共6份，按“2.3.2”項下方法制備供試液，按“2.9”項下方法操作。結果，RSD＝1.67%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的桑葉粉末0.5 g，共6份，分別精密加入DNJ標準品溶液，按“2.3.2”項下方法制備供試液，按“2.1”項下色譜條件依法測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取“2.3.2”項下各藥材供試液，按“2.1”項下色譜條件測定DNJ含量，結果見表2；色譜圖見圖1。

3 討論

通過二極管陣列檢測器得到DNJ-FMOC的最大吸收波長為265 nm，因此確定檢測波長為265 nm。在此波長下，DNJ-FMOC的靈敏度高，所得色譜圖基線平穩。

表2 蠶桑資源中DNJ的含量測定結果（n＝3）Tab 2Determination of DNJ in mulberry resources（n＝3）

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

筆者考察了不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液為流動相時DNJ-FMOC的分離效果，確定以乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（50∶50）為流動相進行分析，DNJ-FMOC與衍生試劑FMOC-Cl及其它峰的分離度良好，峰形最佳。

DNJ無共軛體系，常用的檢測方法中HPLC-ELSD靈敏度低，HPLC-FLD存在熒光強度受外界因素（溫度、溶劑、pH值）影響大的問題，而GC-MS、LC-MS使用成本高，不能在一般實驗室普及。本試驗采用柱前衍生、HPLC-UV檢測，方法具有對檢測儀器要求低、操作簡單快速、衍生產物穩定、測定結果準確等特點，可用于蠶桑資源中多羥基哌啶生物堿的定量分析，對蠶桑類中藥材的綜合質量評價具有重要的意義。

[1]孫 蓮，孟 磊，閻 超.桑葉的降血糖活性成分和藥理作用[J].中草藥，2002，33（5）：471.

[2]孫 偉，李 靜，李婭娟.慢性肝炎治療藥物研究新進展[J].中國藥房，2002，13（5）：29.

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