一種苦蕎抗真菌肽的純化及抑菌活性分析

白承之， 王轉花*， 李玉英

(化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006)

一種苦蕎抗真菌肽的純化及抑菌活性分析

白承之， 王轉花*， 李玉英

(化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006)

以苦蕎種子為材料，經提取、熱處理，Resource S陽離子交換層析及Superdex Peptide分子篩層析，純化具有抗真菌活性的多肽。Tricine-SDS-PAGE分析表明，該多肽的表觀分子質量約為8.0kD。表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF)顯示其實際分子質量為3.909kD。該抗菌肽對白腐菌(Panus conchatus)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和鏈格孢霉(Alternaria alternata)均表現出顯著的生長抑制活性。綠色木霉的形態學分析顯示：受到苦蕎抗真菌肽影響的菌絲生長停滯，分支加劇，基內菌絲端部膨大，原生質凝縮。該抗真菌肽的制備工藝簡單，產品熱穩定性好，抑菌作用明顯。

苦蕎；抗真菌肽；純化；抑菌活性；形態學分析；熱穩定性

Abstract ：An antifungal peptide (AFP) having the ability to protect organisms against fungal invasion was isolated from tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) seeds. The purification procedure involved extraction with 20 mmol/L Tris-HCl buffer, heating treatment, Resource S cation exchange column chromatography, and size exclusion chromatography (SEC) on Superdex peptide column. The apparent molecular weight of the purified peptide was approximately 8.0 kD evaluated by Tricine-SDS-PAGE, and its actual molecular weight was 3.909 kD determined by surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight (SELDI-TOF). This peptide showed strong antifungal activity against Panus conchatus, Trichoderma reesei and Alternaria alternate and could cause swelling hyphal tips, hyphal distortion and condensed protoplasm in Trichoderma reesei. The easy preparation, high thermal stability and potent antifungal activity of this antifungal peptide demonstrate its great potential in food industry.

Key words ：tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum)；antifungal peptide；purification；antifungal activity；light microscopic examination；thermal stability

在過去的數十年中，來自于細菌、真菌(酵母，霉菌或可食用真菌)[1-2]、高等植物(豆科和非豆科來源的植物種子)[3]、無脊椎動物(家蠅)、低等脊椎動物(蟾)[4]、哺乳動物和人類的抗真菌蛋白或抗真菌肽(antifungal proteins and peptides，AFPs)陸續被純化和鑒定。AFPs是具有真菌生長抑制活性的一系列蛋白質的統稱，分子質量在10kD以上的習慣稱為抗真菌蛋白，已知的有幾丁質酶、類幾丁質酶、蛋白酶抑制劑、核糖體失活蛋白[5]等；而分子質量小于10kD的稱為抗真菌肽，可能為脂轉運肽[6]、類防御素肽或無其他生物活性的抗真菌肽。來源于高等植物的抗真菌肽尤其受到關注，因為這類抗真菌肽一般具有來源廣泛，抗菌譜廣[7]，熱穩定性高[8]等優點，在未來的農業和食品工業有潛在的利用前景。

苦蕎(Fagopyrum tataricum)含有豐富的生物活性成分，目前研究報道較多的是其中的生物類黃酮、抗營養因子及過敏性成分等[9]，有關蕎麥抗真菌肽僅見Leung 等[10]報道的一種來自甜蕎種子中的抗真菌肽。本實驗以苦蕎為材料，提取、純化抗真菌肽，并對其分子特征、抑菌活性進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、菌種與儀器

苦蕎為貴州威黑蕎，由山西省農業科學院農作物品種資源研究所提供。

所用試劑均為國產分析純。

鏈格孢霉(Alternaria alternata)、白腐菌(Panus conchatus)、綠色木霉(Trichoderma reesei)由山西大學生命科學與技術學院提供。

Resource S離子交換層析柱、Superdex Peptide HR10/300排阻層析柱 GE Healthcare公司；表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF) Ciphergen公司。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎種子抗真菌肽的純化

2008年收獲的苦蕎種子經過低溫干燥處理，于粉碎機中粉碎，過0.2mm孔徑篩網，以3:1(V/m)的比例加入丙酮，在低溫條件下攪拌脫脂3h。減壓抽濾，棄丙酮，收集濾餅，加入少量乙醚攪拌，減壓抽濾，棄乙醚，收集濾餅，低溫下干燥，所得粉末為苦蕎種子脫脂粉。

取苦蕎種子脫脂粉，以10:1(V/m)的比例加入浸提緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0)，在4℃條件下攪拌浸提6h，12000×g離心棄沉淀，在上清中加入硫酸銨至80%飽和度，4℃條件下攪拌鹽析3h，12000×g離心棄上清，沉淀用浸提緩沖液溶解，并用截留分子質量為3kD的透析袋充分透析，所得蛋白溶液為苦蕎種子水溶性總蛋白。

取上述水溶性總蛋白，在80℃恒溫水浴中熱處理20min，12000×g離心，除去熱不穩定的雜蛋白，收集上清液中對熱穩定的目的蛋白，進一步采用離子交換層析和分子篩層析在AKTA purifier蛋白純化系統上分離。經過熱處理的苦蕎種子水溶性總蛋白，用Resource S陽離子交換層析平衡緩沖液充分透析后，上樣于Resource S陽離子交換柱(1mL)。平衡緩沖液條件：20mmol/L NH4OAc pH4.5，洗脫緩沖液條件：20mmol/L NH4OAc，1mol/L NaCl，pH4.5，流速為0.5mL/min，待穿透峰被完全洗脫之后，設置40mmol/L NaCl的不連續梯度洗脫。收集各洗脫峰，進行抗真菌活性的篩選。

收集到的活性組分用分子篩層析的平衡緩沖液(20mmol/L Tris-HCl 150mmol/L NaCl pH8.0)充分透析，上樣于Superdex Peptide HR 10/300層析柱，流速為0.5mL/min，收集活性洗脫峰。

1.2.2 分子質量測定

分子篩層析獲得的活性組分使用Tricine-SDS-PAGE[11]進行分子質量估計和純度鑒定，4%濃縮膠，16.5%分離膠，考馬斯亮藍R-250染色，并在凝膠成像系統中使用GeneTools software軟件進行純度分析。

為了得到苦蕎種子抗真菌肽準確的分子質量，排阻層析獲得的活性組分，使用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF)進行分子量測定[12]，使用CM-10(弱陽離子交換芯片)進行蛋白質吸附，結果使用Ciphergen ProteinChip Software進行分析。

1.2.3 真菌生長抑制活性檢測及形態學觀察

選擇綠色木霉(Trichoderma reesei)、鏈格孢霉(Alternaria alternata)和白腐菌(Panus conchatus)為受檢真菌，使用牛津杯法[13]檢測各層析組分對真菌生長的抑制作用。具體方法為：準備PDA培養基平板，將供試霉菌點植于培養基中心，于28℃培養至霉菌菌落直徑達到1～2cm，在菌落外圍放置滅菌的牛津杯，距離菌落邊緣1cm，樣品組(含目的蛋白)和對照組(不含目的蛋白而其他條件完全相同的緩沖液)各取200μL，使用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，加入牛津杯內，在4℃預擴散24h，將培養基轉移到28℃培養箱中培養72h后觀察菌落生長狀況。將樣品組和對照組的菌絲直接置于倒置顯微鏡下觀察菌絲形態[14]。

2 結果與分析

2.1 苦蕎種子抗真菌肽的純化

圖1 苦蕎種子抗真菌肽的Resource S陽離子交換層析Fig.1 Resource S cation exchange column fractionization of hydrolysates of thermal treated water-soluble proteins from tartary buckwheat

圖2 陽離子交換層析活性洗脫峰Ⅳ的Superdex Peptide HR 10/300凝膠排阻層析Fig.2 Size exclusion chromatographic profile of fraction IV obtained in resource S cation exchange column fractionization on Superdex Peptide HR 10/300 column

苦蕎種子水溶性總蛋白經過80℃恒溫水浴20min，離心棄沉淀，上樣于Resource S陽離子交換柱，獲得4個層析峰(圖1)，僅有峰IV顯示出抗真菌活性，將峰IV上樣于Superdex Peptide HR 10/300分子篩層析柱，得到一個單峰(圖2峰I)，抑菌實驗顯示該峰具有抗真菌活性。

2.2 分子質量測定

圖3 苦蕎種子抗真菌肽的Tricine-SDS-PAGE結果Fig.3 Tricine-SDS-PAGE of the purified antifungal peptide and watersoluble proteins from tartary buckwheat

圖3顯示，經過熱處理以及兩步層析，目的多肽得到了高度純化，其在電泳過程中的表觀分子質量約為8.0kD，使用GeneTools software軟件灰度掃描分析可知，表達產物的純度均達到95%以上。

圖4 苦蕎種子抗真菌肽的SELDI-TOFFig.4 SELDI-TOF mass spectrum of the purified antifungal peptide

質譜結果顯示該多肽的實際分子質量為3.909kD(圖4)，該結果與目的多肽在Superdex Peptide HR 10/300 分子篩層析結果(圖2)一致。

2.3 真菌生長抑制活性檢測及形態學觀察

圖5顯示，3株供試霉菌在目的多肽的作用下，均受到顯著的生長抑制作用，對于鏈格孢霉和白腐菌，抗菌肽會造成菌落邊緣形成類似弦月的抑制形態。對于依靠孢子增殖的綠色木霉而言，菌絲可以繞過抑制區繼續擴散，抑制區的菌落會形成一個類似抑菌圈的抑制形態，而對照組的菌落邊緣為規則的圓形，顯示沒有任何生長抑制。

圖5 苦蕎種子抗真菌肽對3株真菌生長抑制作用的定性實驗Fig.5 Antifungal activity of the purified antifungal peptide against three species of fungi

為了進一步證明實驗獲得的苦蕎抗真菌肽的抑菌作用，選擇綠色木霉平板在倒置顯微鏡下進行形態學觀察。如圖6所示，抗真菌肽可以顯著抑制綠色木霉的生長，與對照組(A)相比，樣品組(B)菌絲生長受到抑制，生長停滯, 頂端分支加劇，菌落形成清晰界面；樣品組(D)與對照組(C)相比則出現基內菌絲端部膨大，出現泡狀物，樣品組(E)顯示菌絲原生質凝縮，呈現出片段化特征，而對照組(C)菌絲光滑，均勻，形態正常，未出現生長受到抑制的形態特征。

圖6 苦蕎種子抗真菌肽對綠色木霉生長抑制作用的形態學觀察Fig.6 Light microscopic examination of the purified antifungal activity against Trichoderma reesei

3 討 論

在農業和食品工業領域，腐生絲狀真菌(霉菌)的污染始終是人們關注的焦點。多種農藥以及食品防腐劑因為不符合新的食品安全要求而停止使用，同時，抗真菌肽因其來源廣泛、抗菌譜廣、對人無毒、對環境無公害的特征越來越得到學術界的廣泛關注。和抗真菌蛋白相比，抗真菌肽具有熱穩定性好、不致敏等特點，在食品工業的應用潛力巨大。多種植物種子來源的抗真菌肽已經得到純化和鑒定[5-6]。

本實驗以我國小雜糧作物——苦蕎為研究對象，經過陽離子交換層析和分子篩層析兩步層析純化，分離得到純度較高的苦蕎種子抗真菌肽。與已報道的純化手段相比[10]，該方法簡便、成本較低、產物損失減少。其中，純化之前的熱處理步驟可以使大量與本研究無關的雜蛋白變性除去，使其后續的層析步驟變得簡化。而本實驗分離的抗真菌肽是熱穩定多肽，并不會受到影響。質譜實驗顯示抗真菌肽的分子質量為3.909kD。

真菌生長抑制活性實驗顯示，苦蕎種子抗真菌肽對于3種常見的農業致病真菌——綠色木霉、鏈格孢霉和白腐菌均有強的生長抑制作用。形態學觀察結果與目前報道的其他來源的抗真菌肽作用于不同真菌的結果十分吻合[14-15]，從而進一步證明苦蕎抗真菌肽的真菌生長抑制作用。

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Purification and Activity of an Antifungal Peptide from the Seeds of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

BAI Cheng-zhi，WANG Zhuan-hua*，LI Yu-ying
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology,Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Q516；R392

A

1002-6630(2010)15-0004-04

2009-11-05

國家自然科學基金項目(30870525；30671084)；山西省自然科學基金項目(2007011077)

白承之(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為生物活性物質。E-mail：200723002001@mail.sxu.cn

*通信作者：王轉花(1956—)，女，教授，博士，研究方向為蛋白質化學與工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn