方波脈沖電穿孔法提高酵母菌細胞通透性的條件優(yōu)化

冀照君，孫 波*，遲玉杰，徐 寧

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

方波脈沖電穿孔法提高酵母菌細胞通透性的條件優(yōu)化

冀照君，孫 波*，遲玉杰，徐 寧

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為了采用電穿孔法提高酵母菌細胞的通透性，將通過離心得到的酵母菌制成1×108CFU/mL的菌懸液，采用不同的方波電脈沖條件對其進行處理。結(jié)果表明：在0.6mol/L的蔗糖等滲電脈沖介質(zhì)中，當酵母菌細胞的處理條件為電場強度7kV/cm，脈沖寬度50μs，脈沖數(shù)14，間隔時間2s時，細胞的存活率平均為81.16%，電穿孔率平均為65.14%。這表明電穿孔法可以有效增強酵母菌細胞的通透性。

方波脈沖；電穿孔法；酵母菌；通透性

Abstract ：Yeast (Saccharomyces cerevisiae CICC 1012) cells were statically cultured in YEPD medium at 30 ℃ for 24 h and then separated by centrifugation at 3000 r/min after the end of culture and suspended in an electric pulse medium (containing sucrose, Tris-HCl and MgCl2, at pH 7.5) at a cell concentration of 1×108CFU/mL before square-wave electric pulse treatment under different operating conditions. Electric field strength of 7 kV/cm, pulse duration of 50μs, pulse number of 14, time interval of 2 s, and sucrose concentration of 0.6 mol/L were found optimum. The percentage survival of yeast cells was 81.16% and the percentage of electroporated yeast cells was 65.14% under these optimum conditions. This study suggests that the permeability of yeast cells can be increased by square-wave electroporation.

Key words：square-wave electric pulse；electroporation；yeast；permeability

電穿孔是一種利用電脈沖克服細胞膜屏障的過程[1]。即在電場作用下，細胞壁組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，細胞膜脂雙層上形成瞬時孔洞[2]，細胞膜的通透性和膜電導(dǎo)瞬時增大，使正常情況下不能通過細胞膜的分子(如親水分子、病毒顆粒、DNA、蛋白質(zhì)以及染料顆粒等)得以進出細胞的一個生物物理過程[3-4]。電場造成細胞的電穿孔有兩種形式：可逆電穿孔和不可逆電穿孔[5-6]。如果脈沖條件不超過某一臨界限度，這種通透性是可逆的，否則細胞可以遭到不可逆的損傷或死亡[7-8]。由于該技術(shù)簡單、快速、高效[9]，目前己廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、基因工程、臨床醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域[10]。

目前，關(guān)于電穿孔在細胞轉(zhuǎn)化、增加細胞通透性等方面的應(yīng)用研究越來越多。研究者們利用適當?shù)碾姶┛讞l件可以達到提高轉(zhuǎn)化效率或者細胞通透特性等目的。Suga等[5]的研究結(jié)果表明，裂殖酵母的最佳轉(zhuǎn)化電場強度為7.5～12.5kV/cm。Shirakashi等[11]采用流式細胞儀直接定量測定了細胞對大分子的富集量。肖華娟等[4]采用肝癌細胞HePG2作為靶細胞，發(fā)現(xiàn)隨著電場強度或脈沖寬度的增加，細胞膜穿孔率相應(yīng)增強；同時發(fā)現(xiàn)細胞膜電穿孔具有累積效應(yīng)。汪和睦等[12]確定了橢圓釀酒酵母AS2-607(南陽6號“K”)質(zhì)膜的電穿孔條件為RC脈沖電場，幅度5～10kV/cm，脈沖的時間常數(shù)小于30μm。但關(guān)于用方波脈沖對酵母菌細胞進行電穿孔以增加其通透特性的研究尚未見報道。

本實驗擬采用不同的電脈沖條件對酵母菌進行處理，在保證酵母菌細胞存活率較高的情況下，盡量增加細胞的通透特性，以確定最適的電穿孔條件。以為進行更深入的研究(將藥物成分滲透到細胞內(nèi)[6]，激活細胞膜的傳輸因子，提高酶的活性來加快酵母菌細胞的代謝速率等)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC 1012)由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

蔗糖 北京金匯太亞化學(xué)試劑有限公司；Tris 上海化學(xué)試劑公司；MgCl2北京康普匯維科技有限公司；電脈沖介質(zhì)[13](270mmol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L MgCl2，pH7.5)。

YEPD(yeast extract peptone dextrose)液體擴培培養(yǎng)基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，水1000mL，pH值自然。

1.2 儀器與設(shè)備

ECM830型方波電穿孔儀、0.2cm樣品杯 美國BTX公司；AA-650型原子吸收分光光度計 日本島津公司；TDZ4臺式自動平衡離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體的收集

從斜面上挑取兩環(huán)酵母菌接入100mL 4°Bix麥芽汁中，30℃靜止培養(yǎng)24h，然后按照體積分數(shù)1%的接種量接入YEPD液體擴培培養(yǎng)基中，30℃靜止培養(yǎng)24h。3000r/min離心10min，收集菌體[14]。菌體用生理鹽水洗滌3次，然后用電脈沖介質(zhì)洗滌2次。

1.3.2 酵母菌懸浮液的準備

將離心得到的菌體懸浮于電脈沖介質(zhì)中，使得酵母菌濃度為1×108CFU/mL[6]，置于冰浴中5min[15]。

1.3.3 酵母菌電脈沖處理

取0.4mL懸浮液于0.2cm的樣品杯中[15]，然后將樣品杯放于樣品池，調(diào)節(jié)電場強度、脈沖寬度、脈沖數(shù)和間隔時間，對酵母菌進行電脈沖處理。

1.3.4 酵母菌細胞的掃描電鏡觀察

將電穿孔前后的酵母菌細胞進行戊二醛固定，然后用不同體積分數(shù)的梯度乙醇(30%、50%、70%、90%)各處理15min進行脫水，最后用無水乙醇進行脫水兩次，于二氧化碳臨界點下冷凍干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡下進行觀察。

1.3.5 酵母菌存活率的測定

迅速取電脈沖處理后的菌懸液0.1mL于0.9mL生理鹽水中，冰浴5～10min，然后將其置于10～11℃保持40min[8]，進行稀釋，涂布計數(shù)。分別計算電脈沖處理前后酵母菌的總數(shù)。

1.3.6 菌懸液鉀離子含量測定及酵母菌電穿孔率計算

電脈沖處理后，細胞立即移入冷凍的安剖管中，冰浴5～10min，然后將其置于10～11℃保持40min，使得細胞內(nèi)和細胞外的離子濃度平衡。菌懸液的鉀離子濃度采用原子吸收分光光度計進行測定，并作未進行電脈沖處理的空白實驗。鉀離子測定參數(shù)[16]見表1。

表1 鉀離子測定參數(shù)Table 1 Atomic absorption spectrometric parameters for K+determination

電穿孔率由式(2)計算：

式中：[K+]x為電脈沖后菌懸液的鉀離子含量；[K+]0%未進行電脈沖處理菌懸液的鉀離子含量；[K+]100%細胞全部電穿孔后菌懸液的鉀離子含量[8]。為了得到[K+]100%，將電脈沖處理后的菌懸液4000r/min離心15min，測定離心后的鉀離子含量，當離心后的鉀離子含量增加到最大并且不再變化時，所對應(yīng)離心前的最小鉀離子含量即為[K+]100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 電脈沖介質(zhì)中蔗糖濃度的確定

圖1 電脈沖介質(zhì)濃度對酵母菌細胞存活率和電穿孔率的影響Fig.1 Effects of sucrose concentration on the percentage survival of yeast cells and the percentage of electroporated yeast cells

在酵母菌細胞電脈沖過程中，電脈沖介質(zhì)的滲透壓是一個非常重要的因素[5]。因此，首先確定出電脈沖介質(zhì)的滲透壓。在實驗過程中，選擇電脈沖介質(zhì)濃度為0.1～1.0mol/L，在電場強度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，脈沖數(shù)為12，間隔時間為2s的條件下，對酵母菌細胞進行電脈沖作用，分別測定細胞的存活率和電穿孔率，結(jié)果見圖1。蔗糖濃度對電穿孔率影響較小，而對存活率的影響較大，當蔗糖濃度小于0.5mol/L時，存活率較低，這是因為低滲溶液中，細胞溶脹作用阻止了膜的正常恢復(fù)，引起膜不可逆的破壞。相反，高滲溶液(蔗糖濃度大于0.7mol/L以上)中細胞的存活率也下降，這是因為細胞內(nèi)部水分的流動而導(dǎo)致細胞收縮，這樣也增加了細胞膜的破壞。相比之下，等滲條件(蔗糖濃度為0.5～0.7mol/L)下，膜的恢復(fù)不會受到阻礙，細胞的存活率最高(79.4%～80.3%)，這是因為細胞內(nèi)外等滲平衡[5]。該濃度與張華山等[17]和趙悅茗等[18]研究酵母菌原生質(zhì)體穩(wěn)定劑的滲透壓結(jié)果一致。因此，下面確定脈沖條件的實驗中所配制電脈沖介質(zhì)選擇蔗糖濃度為0.6mol/L的等滲溶液((0.6±0.1)mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L MgCl2、pH7.5，超純水配制)。

2.2 電場強度和脈沖寬度對酵母菌細胞電穿孔通透性的影響

為了獲得酵母菌電穿孔的最佳電場強度和脈沖寬度，分別將電場強度范圍設(shè)定為1～12kV/cm，脈沖寬度分別為10、30、50、70、90μs，脈沖數(shù)為12，間隔時間為2s，對酵母菌進行電脈沖處理，測定電穿孔后酵母菌的存活率和電穿孔率，結(jié)果如圖2、3所示。

圖2 電場強度對酵母菌細胞電穿孔率的影響Fig.2 Effect of electric field strength on the percentage of electroporated yeast cells

圖3 電場強度對酵母菌細胞存活率的影響Fig.3 Effect of electric field strength on the percentage survival of yeast cells

由圖2、3可知，總體趨勢是隨著電場強度的增加，酵母菌細胞的電穿孔率逐漸增大，存活率卻逐漸下降。當電場強度小于4kV/cm時，即使增加脈沖寬度，酵母菌細胞的電穿孔率也僅僅達到13.9%，存活率始終接近于100%。當電場強度大于4kV/cm以后，電穿孔率開始迅速增加，存活率開始緩慢下降，這種變化規(guī)律與Weaver等[19]的研究結(jié)果一致。

由于采用的脈沖寬度不同，所以電穿孔率和存活率的變化速率不同。脈沖寬度為10μs時，雖然細胞的存活率較高，但電穿孔率較低，最大也只能達到50.3%(此時的存活率只有69.8%)；相反，如果調(diào)節(jié)脈沖寬度為70μs或90μs時，細胞的電穿孔率上升較快，而存活率迅速下降。綜合以上實驗結(jié)果，在保證細胞存活率較高的同時，盡量增大電穿孔率，因此，選擇電場強度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，此時，酵母菌細胞的存活率為80.43%，電穿孔率為57.49%。

2.3 脈沖數(shù)對酵母菌細胞電穿孔通透性的影響

在電場強度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs的條件下，將脈沖數(shù)分別調(diào)節(jié)為2、4、6、8、10、12、14、16、18和20個，間隔時間為2s，對酵母菌進行電脈沖處理，分別測定酵母菌細胞的存活率和電穿孔率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 脈沖數(shù)對酵母菌細胞存活率和電穿孔率的影響Fig.4 Effect of pulse number on the percentage survival of yeast cells and the percentage of electroporated yeast cells

由圖4可以看出，脈沖數(shù)對酵母菌的存活率影響較小，但對酵母菌的電穿孔率影響顯著。隨著脈沖數(shù)的增加，酵母菌細胞的存活率從96.4%下降到47.3%，電穿孔率從10.1%增大到98.8%。因此，選擇脈沖數(shù)為12～14時，酵母菌細胞的存活率較高。

2.4 正交試驗

為了進一步研究電脈沖條件的各因素對酵母菌細胞通透性的影響，在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上，以電場強度、脈沖寬度、脈沖數(shù)為因素，每個因素選取3個水平進行試驗，分別測定酵母菌細胞的存活率和電穿孔率，結(jié)果如表2所示。各因素對細胞存活率和電穿孔率的影響順序均為：即電場強度＞脈沖寬度＞脈沖數(shù)。細胞的存活率和電穿孔率呈負相關(guān)性，但由于試驗?zāi)康氖菫榱吮ＷC細胞存活率較高的同時，盡量增大其電穿孔率，因此，綜合考慮正交試驗結(jié)果，選擇最適條件為：A2B2C3，即電場強度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，脈沖數(shù)為14。

表2 正交試驗確定最適電脈沖條件Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing square-wave electric pulse treatment conditions

2.5 驗證實驗

設(shè)置電場強度為7kV/cm，脈沖寬度為50μs，脈沖數(shù)為14，間隔時間為2s，在此條件下對酵母菌細胞進行電脈沖處理，酵母菌細胞的存活率平均為81.16%，電穿孔率平均為65.14%。這與Suga等[5]和Weaver等[19]的研究結(jié)果相近。

2.6 酵母菌細胞的電鏡觀察

為了直觀的描述方波脈沖對酵母菌細胞的電穿孔現(xiàn)象，采用掃描電子顯微鏡對其進行觀察，結(jié)果見圖5。

圖5 酵母菌細胞電穿孔前后的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5 Scanning electron micrographs of yeast cells before and after electroporation

由圖5可以看出，電穿孔前的酵母菌細胞較完整，表面光滑且無雜物，而電穿孔后的酵母菌細胞表面粗糙，并且表面附有許多碎片，這可能是由于細胞通透性增加后，還沒來得及固定，可逆孔洞就開始復(fù)原，形成了非常粗糙的表面，這可以證明細胞的可逆電穿孔洞維持的時間極短，在幾秒內(nèi)就會復(fù)原。

3 討 論

酵母菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用日趨廣泛，其中釀酒酵母是較好的研究對象[20]。本研究最終確定了增強酵母菌細胞通透性的最佳電穿孔條件，結(jié)果表明電穿孔法可以有效改變酵母菌的通透性。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)電場強度和脈沖寬度對酵母菌細胞存活率和電穿孔率的影響都較明顯，這是因為施加的電場強度決定了細胞兩側(cè)電壓的大小，該電壓使細胞結(jié)構(gòu)瞬間變化，脈沖寬度的長短決定了細胞是否出現(xiàn)微孔，并使之增大[21]。

當脈沖寬度一定，細胞膜兩側(cè)電壓達到臨界跨膜電壓時，細胞才會發(fā)生電穿孔現(xiàn)象，如果電場強度較低，只有一些體積較大的細胞兩側(cè)積累的電荷才可以使細胞形成孔洞，大部分細胞還未能形成孔洞；如果電場強度太大，細胞兩側(cè)的電壓遠遠超過了臨界電壓，細胞上就會形成不可恢復(fù)的較大孔徑，細胞內(nèi)容物容易溶出，細胞死亡[22]。然而當脈沖寬度較低時，細胞形成的孔洞會很快恢復(fù)，細胞內(nèi)離子還沒有來得及釋放，因此測得的鉀離子含量較小，即電穿孔率較小[23]；相反的，當脈沖寬度較大時，細胞形成了較大的不可逆孔洞，致使細胞的存活率下降。因此，選擇合適的電場強度和脈沖寬度對于酵母菌細胞微孔的形成非常重要。

脈沖數(shù)較低時，受到電場作用的細胞數(shù)較少，或形成非常微小的孔洞，并且該微孔恢復(fù)非常迅速，這些微孔對一些離子還具有選擇性[24]，如果要通過膜孔導(dǎo)入大分子或者DNA，則需要更大的孔徑[25]；當脈沖數(shù)增加后，細胞受到電脈沖作用的次數(shù)增加，導(dǎo)致孔洞形成的數(shù)量在增加，加速了離子的流動[25]；更多的脈沖數(shù)不僅增加了孔洞數(shù)，而且會使得已經(jīng)形成孔洞的細胞繼續(xù)受到電脈沖作用，細胞結(jié)構(gòu)來不及復(fù)原，并且多次作用后，細胞孔徑增大，容易形成不可逆的孔洞[22]。

電致孔洞的復(fù)原機制至今仍處于理論模型階段[26]。一般細胞電穿孔的可逆性和復(fù)原時間是由維持孔洞邊緣的能量來確定，如果維持孔洞邊緣的勢能比恢復(fù)雙分子層的勢能高，則孔洞就不穩(wěn)定，膜將很快復(fù)原，否則孔洞將繼續(xù)擴大。實際細胞膜上孔洞的復(fù)原非常復(fù)雜，不單只與類脂分子的極性頭部的親水作用和碳氫鏈的范德華引力有關(guān)，還與膠體滲透作用、溶液離子作用和膜蛋白的影響等有關(guān)[21]，因此，電致孔洞的復(fù)原機制還有待進一步深入研究。

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Optimization of Square-wave Electroporation for Increasing the Permeability of Yeast Cells

JI Zhao-jun，SUN Bo*，CHI Yu-jie，XU Ning
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Q93.31

A

1002-6630(2010)15-0050-05

2009-11-23

黑龍江省“十一五”科技攻關(guān)計劃項目(GA06B402-86-6)

冀照君(1982—)，男，助教，碩士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵。E-mail：jzj808@163.com

*通信作者：孫波(1964—)，男，副教授，碩士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵。E-mail：bosun1962@163.com