RBP4對游泳訓練大鼠脂肪細胞IR和IRS-1蛋白表達和磷酸化的影響

張明軍

RBP4對游泳訓練大鼠脂肪細胞IR和IRS-1蛋白表達和磷酸化的影響

張明軍

目的：觀察視黃醇結合蛋白4（RBP4）對大鼠脂肪細胞IR和IRS-1蛋白表達和磷酸化的影響。方法：RBP4孵育8周游泳運動組和安靜對照組大鼠（8周齡SD）脂肪細胞，檢測脂肪細胞葡萄糖攝取、IR和IRS-1蛋白表達和磷酸化。結果：RBP4孵育后，運動組大鼠脂肪細胞基礎和胰島素刺激狀態下葡萄糖攝取率顯著高于安靜對照組，游泳運動組和安靜對照組大鼠脂肪細胞IR蛋白表達、磷酸化和IRS-1蛋白表達變化無統計學差異。RBP4孵育后，運動組大鼠脂肪細胞IRS-1磷酸化程度較安靜對照組顯著增加。結論：8周游泳運動能夠增加RBP4孵育后的大鼠脂肪細胞葡萄糖攝取和IRS-1磷酸化程度，改善RBP4誘導的脂肪細胞胰島素抵抗。

游泳運動；視黃醇結合蛋白4；胰島素抵抗；胰島素受體；胰島素受體底物

胰島素受體（IR）與胰島素結合后酪氨酸殘基發生自磷酸化，為下游的船塢蛋白（docking protein）提供結合位點，這些下游蛋白隨后發生一系列的磷酸化，將胰島素信號向下游傳導，調節細胞的葡萄糖攝取和其他代謝功能，胰島素受體底物（IRS）即是這種蛋白中的一類。胰島素信號傳導缺陷是胰島素抵抗發生的主要原因，為了順利傳導胰島素信號，胰腺β細胞分泌更多的胰島素，最終β細胞功能失代償，出現2型糖尿病。胰島素抵抗細胞的受體、受體底物數量和磷酸化程度會隨著細胞外胰島素濃度的改變而發生相應變化，以適應胰島素濃度的增加[1]，在一定程度上維持胰島素功能的正常發揮。

視黃醇結合蛋白4（RBP4）是一個新發現的導致胰島素抗性的脂肪因子，在胰島素抗性發展中起到一個關鍵作用，具有胰島素抗性的小鼠和患有肥胖和2型糖尿病的病人體內，血清RBP4的水平是升高的[2]。前期研究發現：2型糖尿病大鼠附睪脂肪中RBP4mRNA和蛋白表達增加，循環RBP4水平升高，出現胰島素抵抗，8周游泳運動能夠降低2型糖尿病大鼠附睪脂肪中RBP4mRNA、蛋白表達和循環RBP4水平，緩解胰島素抵抗[3]。為探討運動如何通過影響RBP4而改善胰島素抵抗，本研究對運動大鼠脂肪細胞進行培養，在體外觀察RBP4對脂肪細胞葡萄糖轉運以及對IR和胰島素受體底物1（IRS-1）蛋白表達和磷酸化的影響，探索運動改善胰島素抵抗的新機制。

1 研究材料與方法

1.1 材 料

胰島素、2-Deoxy-D-[I-3H]-glucose購自Biogenesis（Poole，UK）；抗胰島素受體（IR）、胰島素受體底物1（IRS1）抗體，抗IR磷酸化（Y1355）和IRS-1（Ser 307）磷酸化抗體均購自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA），相應的Ⅱ抗體均購自北京中杉金橋公司，其余試劑為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 大鼠脂肪細胞的分離和活性檢測 SD雄性大鼠，8周齡，體重180～210 g，上海斯萊克實驗動物公司提供，許可證號：SCXK（滬）2003-0003。隨機分為游泳運動組和安靜對照組，每組12只。運動組按照Ploug方法[4]訓練8周，每周訓練5天，每天無負重游泳60 min。安靜對照組大鼠浸水后撈出。第8周末運動后斷頭處死大鼠，參照Rodbel[5]方法分離24只大鼠附睪脂肪細胞，分別配制成24份1×106個/mL的細胞懸液，0.4%臺盼藍1∶9與細胞懸液混合，3 min內計數活脂肪細胞（未著色細胞）占總脂肪細胞數百分比，結果顯示存活率大于99%。

1.2.2 脂肪細胞培養、RBP4孵育和葡萄糖攝取率的檢測 取計數的24份大鼠脂肪細胞懸液0.5 mL，分別加入聚丙烯培養管中37℃、5%CO2的培養箱培養20 h，貼壁后，12份運動大鼠細胞分為等數的2組，分別加入40 μg/L+25 mmol·L-1D葡萄糖，胰島素刺激狀態下葡萄糖攝取組加入10 U·L-1胰島素，基礎狀態下葡萄糖攝取組不添加胰島素。12份安靜大鼠細胞分組方式與運動組相同。繼續培養24 h，冰硅油終止反應，離心除去下層培養液，液閃計數儀測定脂肪細胞葡萄糖攝取率。各組內同比重復2次，實驗共重復5次。

1.2.3 脂肪細胞胰島素刺激狀態下IR和IRS-1蛋白表達的檢測 取運動組和安靜對照組胰島素刺激狀態下脂肪細胞，分別經PBS洗2次，使用細胞溶解液消化1 h，離心15 min（4℃、12 000ⅹg），采取上清液放入-80℃中保存備用。West bloting法測定IR和IRS-1蛋白表達，100 ug細胞溶解物SDS-PAGE蛋白分離，然后轉移至硝酸纖維素膜。在室溫用5%低脂奶粉PBS液封膜3 h。加入抗IR或抗IRS-1抗體（工作濃度1∶4 000）4℃孵育過夜，洗滌后加入相應辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗（工作濃度1∶5 000）分別孵育1 h，洗膜方法同前。充分洗滌后與ECL（增強化學發光劑，英國Amersham）反應，即刻與KadakX-Omat底片曝光洗片后用LeicaQ550-IW圖像分析儀（德國）進行掃描，測定光密度，進行定量分析。

1.2.4 脂肪細胞IR和IRS-1磷酸化的檢測 免疫沉淀檢測IR和IRS-1的磷酸化程度：細胞內總蛋白的提取及濃度測定方法同前；各取100 μg總蛋白，分別加入抗IR和IRS-1抗體（工作濃度1∶2 000），4℃孵育輕搖過夜，加入100 μL10%A-Sepharose進行沉淀，洗滌免疫沉淀復合物后加入50 μL2×SDS上樣緩沖液煮沸5 min；離心3 min，取上清，按前述方法電泳、轉膜、封閉過夜，加抗磷酸酪氨酸抗體（工作濃度1∶1 000），洗膜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（工作濃度1∶5 000）；曝光，洗片，其分析方法同上。

1.3 統計學處理

所有數據以SPSS11.0版進行統計，數據以均數±標準差表示，方差齊性采用Levene檢驗，運動組與安靜對照組進行獨立樣本T檢驗，雙側檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著統計學意義。

2結 果

2.1 脂肪細胞葡萄糖攝取的變化

RBP4孵育后，與安靜組脂肪細胞相比，運動組脂肪細胞基礎狀態下（未添加胰島素）和胰島素刺激狀態下的葡萄糖攝取率顯著增加（P<0.01）（見表1）。

表1 RBP4對脂肪細胞葡萄糖攝取率的影響Table 1 Effects of RBP4 on glucose uptake in lipocyte

2.2 脂肪細胞IR、IRS-1蛋白表達和磷酸化變化

RBP4孵育后，胰島素（10U·L-1）刺激狀態下，運動組和安靜對照組脂肪細胞IR蛋白表達和磷酸化程度差異無統計學意義（P>0.05）；運動組和安靜對照組脂肪細胞IRS-1蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。與安靜對照組相比，運動組脂肪細胞IRS-1磷酸化程度顯著增加（P<0.01）（見圖1-圖3）。

3討 論

RBP4是最近發現的一種脂肪因子，與胰島素抵抗的關系密切。Graham和Qin Yang發現RBP4與胰島素抗性的發生存在某種聯系，通過運動而改善了胰島素敏感性的人和小鼠，其血清中RBP4水平也降低[6]。脂肪細胞是對胰島素敏感的靶細胞之一，常作為胰島素抵抗機制的研究模型，其對胰島素敏感性的改變表現為胰島素刺激狀態下葡萄糖轉運能力的改變[7]。胰島素刺激的脂肪細胞葡萄糖轉運是通過IR、IRS、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和葡萄糖轉運子（GLUT）等一系列信號傳導過程完成的，胰島素信號轉導通路中的任何一個環節異常均可以引起胰島素抵抗。

為研究運動如何通過影響RBP4而改善胰島素敏感性，我們在體外復制了高RBP4生理環境，建立脂肪細胞模型，誘導脂肪細胞出現胰島素抵抗，觀察運動組和安靜對照組大鼠脂肪細胞葡萄糖攝取率變化情況。研究結果顯示，RBP4對運動組大鼠脂肪細胞基礎和胰島素刺激狀態下葡萄糖轉運的抑制程度明顯比安靜對照組輕，表明運動組脂肪細胞耐受RBP4的能力高于安靜對照組，運動組脂肪細胞胰島素敏感性高于安靜對照組，提示運動能夠改善RBP4誘導的脂肪細胞胰島素抵抗，但其作用機制尚不清楚。

胰島素作用于脂肪細胞，將胰島素信號通過胰島素受體實現跨膜傳遞，IR通過膜外部分與胰島素結合，使包括IR、IRS在內的一系列物質磷酸化，胰島素信號得以傳入細胞內，發揮調節細胞生長、繁殖、分化及代謝的生理功能。高RBP4水平能夠誘導大鼠脂肪細胞出現胰島素抵抗，表現出葡萄糖轉運效率下降，而8周游泳運動則能夠改善大鼠脂肪細胞葡萄糖攝取率，提高胰島素敏感性，提示與胰島素信號傳遞有關的信號蛋白表達量發生變化或功能得到改善。為了觀察高RBP4狀態下，運動大鼠脂肪細胞IR蛋白表達變化情況，探索運動改善RBP4誘導的胰島素抵抗的機制，給予大鼠脂肪細胞RBP4孵育后，我們檢測了胰島素刺激后大鼠脂肪細胞IR蛋白表達和磷酸化的變化，結果顯示，RBP4同等程度地抑制了運動組和安靜對照組大鼠脂肪細胞IR蛋白表達和磷酸化。IR是細胞膜受體，與胰島素結合后激活亞基內的受體酪氨酸蛋白激酶，再通過磷酸化細胞內的底物如IRS-1和PI3K等介導包括葡萄糖轉運，糖原合成等信號傳遞途徑。Danielsson A等[8]研究顯示，無論是RBP4孵育正常人或糖尿病者的脂肪細胞后，并沒有影響IR的磷酸化而改變胰島素敏感性。提示RBP4引起的胰島素信號傳導鏈缺陷并不是發生在IR環節。本研究結果也提示：與安靜對照組相比，8周游泳運動沒有增加RBP4孵育后的大鼠脂肪細胞IR蛋白表達和磷酸化，運動改善RBP4誘導的胰島素抵抗機制與IR變化無關，推測IR的下游信號蛋白IRS的變化可能在這一調節機制中扮演重要角色。

為進一步確定運動改善RBP4誘導的胰島素抵抗的作用位點，本研究選擇IRS-1蛋白作為研究對象，觀察RBP4對大鼠脂肪細胞IRS-1蛋白表達和磷酸化的影響，結果顯示，RBP4同等程度地抑制了安靜對照組和運動組大鼠脂肪細胞IRS-1蛋白表達，但RBP4對運動組大鼠脂肪細胞IRS-1蛋白磷酸化的抑制程度顯著低與安靜對照組，提示RBP4孵育后，運動大鼠脂肪細胞IRS-1在胰島素刺激后的磷酸化程度高于安靜對照組，其作用位點和Anita Ost等[9]對人脂肪細胞研究的結果一致。IRS是IR酪氨酸激酶的底物，也是胰島素信號傳遞的中介，IRS家族系列中，IRS-1在胰島素信號傳遞過程發揮重要作用。IRS-1表達量和磷酸化程度的改變都對胰島素抵抗產生影響，研究證明：IRS-1基因剔除小鼠均表現出胰島素抵抗癥狀[10]。脂肪組織是胰島素作用的主要外周靶組織之一，肥胖患者的脂肪細胞IRS-1表達降低，胰島素作用減弱，出現胰島素抵抗[11]，在一些多囊卵巢綜合征合并胰島素抵抗患者子宮內膜IRS-1蛋白的表達也明顯降低[12]。所以，IRS-1mRNA穩定性降低、表達的減少和編碼區變異導致的IRS功能減弱，都可以引起胰島素抵抗。隨后對2型糖尿病病人的研究也證實了IRS-1磷酸化和胰島素抵抗的關系，在骨骼肌被注射胰島素以后，IRS-1酪氨酸磷酸化程度顯著低與正常人[13]。本研究顯示，RBP4孵育后，運動組與安靜對照組大鼠脂肪細胞IRS-1蛋白表達量無顯著性差異，而胰島素刺激下的葡萄糖攝取率卻顯著增加，推測脂肪細胞IRS-1蛋白表達量的變化沒有在運動改善RBP4誘導的胰島素抵抗機制中發揮作用，而脂肪細胞IRS-1磷酸化程度的增加則合理的解釋了運動改善RBP4誘導的胰島素抵抗的作用機制。

綜上所述，8周游泳運動后，大鼠脂肪細胞對RBP4誘導的胰島素抵抗的耐受能力提高，表現為脂肪細胞葡萄糖攝取率增加，脂肪細胞IRS-1磷酸化程度增加，提示8周游泳運動能夠通過增加脂肪細胞IRS-1磷酸化來改善RBP4誘導的胰島素抵抗。本研究不足在于僅僅分析了脂肪細胞的葡萄糖攝取和胰島素信號轉導，對于葡萄糖轉運的其他重要部位，如骨骼肌、肝細胞的情況未做探討，而且體外實驗研究也不能完全模仿體內胰島素作用的生理環境，所以研究結果存在局限性。至于運動干預后，RBP4是否還會影響其他胰島素信號蛋白和酶的活性，則有待進一步研究。

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Effects of RBP4 on Protein Expression and Phosphorylation of IR and IRS-1 in Swimming Rats Lipocyte

ZHANG Mingjun
(School of Sports Sciences,Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China)

Objective:To observe the influence of RBP4 on protein expression and phosphorylation of IR and IRS-1 in rats'lipocyte.Methods:Rats lipocyte (eight weeks SD)of eight weeks swimming rats and control rats were incubated by RBP4.Glucose uptake,protein expression and phosphorylation of IR and IRS-1 in lipocyte were measured.Results:The insulin-stimulated glucose uptake and noninsulin-stimulated glucose uptake increased more in exercise rats than in control rats after RBP4 incubation,respectively.There was no difference between protein expression of IR,IRS-1 and phosphorylation of IR in exercise rats and control rats.Phosphorylation of IRS-1 increased more in exercise rats than in control rats after RBP4 incubation.Conclusion:Eight weeks swimming could increase glucose uptake and phosphorylation of IRS-1 in rat lipocyte after RBP4 incubation respectively,and improve RBP4-induced insulin resistance.

swimming;retional-binding protein-4;insulin resistance;insulin receptor;insulin receptor substrate1

G 804.2

A

1005-0000（2010）01-0038-03

2009-07-27;

2009-09-10；錄用日期：2009-09-11

福建省教育廳科技項目(項目編號:JB08221)

張明軍（1968-），男，安徽滁州人,莆田學院講師、醫師，福建師范大學在讀博士研究生。

莆田學院體育系，莆田351100。