神經病理性痛大鼠鞘內注射GFAP抗體的效應及其血清GFAP的意義

陳建平，屈江波，郭張華，牟曉杰，陳 麗 (山西醫科大學第二臨床醫學院麻醉科，太原 030001)

神經病理性疼痛產生時，大鼠脊髓中的星形膠質細胞激活，其標記物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)明顯增加［1］。研究表明［2］，急性腦損傷時由于血腦屏障功能受損導致血清中GFAP顯著升高，并且其升高幅度可作為腦損傷病人預后的指標。進一步研究發現［3］，在脊神經結扎的神經病理性疼痛模型中，相應脊髓節段存在血脊髓屏障(blood-spinalcordbarrier，BSCB)損傷，這種損傷可導致脊髓內源性白蛋白的滲漏，并且在該節段脊髓受損側灰質中存在GFAP表達升高和星形膠質細胞的激活。但是，這種BSCB的損傷是否會引起GFAP的滲漏仍不清楚，因此，本研究通過觀察血清中GFAP的水平及鞘內注射其相應抗體對神經病理痛的影響，旨在探討GFAP在神經病理性疼痛中的預警及抗GFAP的鎮痛效應。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 GFAP抗體購自美國BD公司;本實驗中所用的其他試劑均購自中國晶美生物公司。Model 680酶標儀(Bio.Rad公司，美國)，The Plantar von FreyTM動態爪底觸覺測量儀(UGO公司，意大利).

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立 18只雌性SD大鼠，體重250－300 g，購自山西醫科大學實驗動物中心。隨機分為三組，分別為正常對照組(C組，n=6)、SNI組(S組，n=6)、SNI+抗 GFAP組(G 組，n=6);其中S組與 G組大鼠均按 Decosterd等［4］的方法建立SNI模型，于左后肢上緣切開皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經的主干及分支——脛神經、腓總神經和腓腸神經，結扎并切斷脛神經和腓總神經，保留細小的腓腸神經，并避免牽拉腓腸神經;G組大鼠在建立SNI模型的同時鞘內注射GFAP抗體10 mg/kg;C組大鼠不做任何處理。

1.2.2 50% 機械縮爪閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)50%MWT是指多次機械刺激能夠引起50%縮爪反應的機械力度，本實驗采取upand-down［5］的方法測定大鼠后趾50%縮爪閾值。依次使用 0.45 g，0.70 g，1.2 g，2.0 g，3.63 g，5.5 g，8.5 g，15.1 g 的力度刺激后趾。開始使用 2 g 的力度刺激，若沒有縮腿反應，則選擇其上的一個力度3.63 g刺激后趾;若有縮腿反應，則選擇其下的一個力度1.20 g刺激后趾。依次類推，在出現一次與前一次不同的反應(有縮腿反應至無縮腿反應或無縮腿反應至有縮腿反應)時，繼續依序刺激4次，包括以前的2次，一共6次，即可完成50%縮腿閾值的測定。若需要使用的力度超過15.1 g或低于0.45 g，該側閾值則直接記為15 g或0.45 g。50%縮爪閾值的計算使用公式:50%縮爪閾值=10log(X)+kδ，X為最后刺激使用的力度;k為不同刺激方式的系數，在文獻［4］附表中查找;δ是指各刺激力度(lg值)相鄰間距的平均數，此處δ=0.224。分別于SNI術前(T0)、術后1－6周(T1－T6)測定各組50%機械縮爪閾值。

1.2.3 ELISA 法檢測各組血清 GFAP(sGFAP)、IL-1β(sIL-1β)和腦脊液GFAP(cGFAP)水平 分別于SNI術前(T0)、術后1－6周(T1－T6)采用截尾法采集大鼠血液，鞘內置管采集腦脊液，以1∶100稀釋的兔抗大鼠 GFAP、IL-1β 包被 ELISA 板(100 μl/孔)，陽性對照孔中分別加1∶100稀釋的 GFAP、IL-1β 100 μl，實驗孔中分別加1∶10稀釋的各組大鼠血清或者腦脊液100 μl。陽性對照孔中加入1∶1 000稀釋的 HRP標記的羊抗小鼠 IgG，實驗孔中加入1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗大鼠IgG，TMB顯色后用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度(A450)值。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0統計學軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用重復測量數據的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 50 %MWT測定 三組術前50%MWT比較差異無統計學意義(P＞0.05)。與T0時比較，S組、G組 T1－T6時50%MWT均低于術前(P＜0.05)，而C組各時點變化差異無統計學意義。與C組比較，S組和G組T1－T650%MWT均降低(均P＜0.05);與S組比較，G組50%MWT升高(P＜0.05)，見表1。

表1各組不同時點50%MWT測定值比較(g，n=6，±s)Tab 1The values of 50%MWT in 3 groups(g，n=6，±s)

表1各組不同時點50%MWT測定值比較(g，n=6，±s)Tab 1The values of 50%MWT in 3 groups(g，n=6，±s)

與 T0比較，*P ＜0.05;同時點與 C組比較，#P ＜0.05;同時點與 S組比較，#P ＜0.05

組別50%MWT 測定值T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 6 13.5 ±1.5 14.2 ±1.3 S 組 14.1 ±1.4 2.3 ±0.8*# 2.1 ±0.6*# 2.5 ±0.7*# 2.8 ±0.8*# 3.0 ±0.6*# 2.9 ±0.8*#G 組 14.5 ±1.3 5.3 ±1.1*#△ 5.8 ±0.9*#△ 6.0 ±0.8*#△ 6.6 ±0.9*#△ 7.5 ±1.0*#△ 8.8 ±1.6*#△C 組 14.2 ±1.4 14.3 ±1.2 13.9 ±1.5 14.0 ±1.2 13.7 ±1.

2.2 ELISA 法檢測血清 GFAP(sGFAP)、IL-1β(sIL-1β)和腦脊液GFAP(cGFAP)水平 術前(T0)三組間sGFAP、sIL-1β和cGFAP水平差異無統計學意義(均P＞0.05)。與T0時比較，T1－T6時S組各項指標升高(P＜0.05)，于T5時達高峰，T6時開始回降;G組術后3－5周時各項指標升高(P＜0.05)，無高峰現象，并于T6時降至術前水平;C組各時點間各指標差異無統計學意義(P＞0.05)。與C組比較，S組T1－T6各時點sGFAP、sIL-1β和cGFAP均升高，G組僅于 T3－T5時有所升高;與 S組比較，G組T3－T6時各指標降低(P＜0.05)，見表2。

表2三組大鼠各指標在不同時點的吸光度值A450(n=6，±s)Tab 2The levels of cGFAP，sGFAP，sIL-1β in 3 groups(n=6，±s)

表2三組大鼠各指標在不同時點的吸光度值A450(n=6，±s)Tab 2The levels of cGFAP，sGFAP，sIL-1β in 3 groups(n=6，±s)

與 T0比較，*P ＜0.05;同時點與 C 組比較，#P ＜0.05;同時點與 S組比較，△P ＜0.05

指標 組別 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 cGFAP C 組 0.19 ±0.06 0.15 ±0.07 0.18 ±0.05 0.16 ±0.07 0.15 ±0.09 0.18 ±0.06 0.19 ±0.07 S 組 0.17 ±0.08 0.42 ±0.08*# 0.56 ±0.09*# 0.48 ±0.06*# 0.47 ±0.11*# 0.60 ±0.12*# 0.43 ±0.05*#G 組 0.19 ±0.01 0.12 ±0.05 0.19 ±0.04 0.30 ±0.10*#△ 0.37 ±0.08*#△ 0.33 ±0.07*#△ 0.23 ±0.03△sGFAP C 組 0.48 ±0.04 0.33 ±0.03 0.42 ±0.06 0.38 ±0.04 0.46 ±0.06 0.41 ±0.04 0.42 ±0.04 S 組 0.50 ±0.12 1.33 ±0.31*# 2.16 ±0.94*# 1.96 ±0.86*# 2.42 ±0.45*# 2.56 ±0.36*# 0.90 ±0.14*#G 組 0.43 ±0.03 0.47 ±0.06 0.56 ±0.11 1.21 ±0.92*#△ 1.16 ±0.78*#△ 1.35 ±0.68*#△ 0.49 ±0.13△sIL-1β C 組 0.35 ±0.02 0.29 ±0.04 0.36 ±0.10 0.32 ±0.09 0.32 ±0.05 0.36 ±0.05 0.30 ±0.07 S 組 0.37 ±0.11 0.91 ±0.15*# 1.27 ±0.98*# 1.29 ±0.91*# 1.28 ±0.86*# 1.33 ±0.91*# 1.12 ±0.87*#G 組 0.33 ±0.04 0.43 ±0.11 0.38 ±0.09 1.02 ±0.13*#△ 0.96 ±0.07*#△ 0.94 ±0.08*#△ 0.35 ±0.07△

3 討論

由各種原因導致的外周神經損傷引起的神經病理性疼痛主要表現為痛覺過敏、痛覺異常和自發性疼痛。本課題組在前期的研究中曾多次成功復制保留神經損傷性神經病理性痛模型(SNI)、觀察了大鼠的機械性觸誘發痛和痛覺異常行為［6］，本次實驗檢測了鞘內給予GFAP抗體的鎮痛效應，同時觀察了 SNI模型血清 GFAP(sGFAP)、IL-1β(sIL-1β)和腦脊液GFAP(cGFAP)的變化。

膠質細胞廣泛分布于大腦和脊髓，占中樞神經細胞總數的70%以上。大量研究證實，神經病理性疼痛產生時，星形膠質細胞被激活，其特異性標志物GFAP表達水平增加，激活的星形膠質細胞可釋放大量的細胞因子IL-1β［7］，引起神經炎癥和神經免疫反應，導致各種神經功能紊亂，引起痛覺過敏和痛覺異常。

有研究者［1］采用免疫組化的方法研究脊神經結扎模型，發現疼痛形成時大鼠脊髓GFAP明顯增加，表明星形膠質細胞的激活與疼痛反應有關。Alexander等［8］的研究表明在復雜區域疼痛綜合征患者中半數有腦脊液中GFAP水平升高。本研究結果也表明，在SNI術后1－6周腦脊液中的GFAP持續增高，并在5周時達到高峰，直至6周才開始回降。另有研究表明［9］，在神經病理性痛的另一種模型，坐骨神經慢性壓迫模型中，大鼠脊髓背角GFAP免疫染色明顯增強。并且外周神經損傷后，星形膠質細胞的GFAP不僅表達增高并且持續時間長，表明星形膠質細胞活化與神經病理性疼痛的維持有關。

GFAP是星形膠質細胞的結構蛋白，正常情況下僅存在于神經系統。中樞神經系統急性損傷時腦脊液中會有大量的GFAP，在創傷性腦損傷病人中，其GFAP會通過受損的血腦屏障進入到血液里，研究證實在受傷后1 h，血清中的GFAP水平就會顯著升高，并可作為腦損傷預后的指標［2］。Gordh 等［3］在L4脊神經結扎大鼠中觀察到在相應脊髓節段存在血脊髓屏障損傷，這種損傷導致了內源性白蛋白的滲漏。本研究結果顯示，神經病理性疼痛大鼠成模后1－5周時血清中的GFAP均升高，5周時達高峰，6周開始回落;與之變化一致，血清IL-1β也呈現相應改變，這可能與血脊髓屏障受損導致白蛋白的滲漏機制一致。

鞘內給予星形膠質細胞代謝抑制劑氟代檸檬酸(fluorocitrate)可顯著減輕神經病理性疼痛的痛覺異常行為［10］，本研究中通過鞘內注射GFAP抗體也顯著減輕大鼠的痛覺異常，同時大鼠血清、腦脊液中GFAP，血清中IL-1β下降;但在鞘內注射2周后即術后3－5周(T3－T5)時，動物又表現出痛覺過敏行為，表明一次性鞘內注射GFAP抗體的作用時間大致持續2周左右。與S組不同的是，G組血清、腦脊液中GFAP，血清中IL-1β未在5周時出現高峰，并于6周時已降至術前水平。表明鞘內注射GFAP抗體可下調GFAP的表達從而緩解神經病理性痛;并且給予GFAP抗體后，可減輕遠期痛覺異常行為(本實驗中6周時，G組50%MWT明顯高于S組，P＜0.05)。本研究中G 組的50%MWT 在T2、T3、T6時未恢復至對照組水平，可能是因為神經病理性痛的發生機制較復雜，除星形膠質細胞和IL-1β外，還有其他因素存在。因此，盡管脊神經結扎后相應節段的脊髓血管屏障的損傷仍然存在，但通過減少GFAP的滲漏，仍可達到減輕神經性疼痛的目的。與檢測腦脊液中的GFAP操作相比，檢測血清中的GFAP要容易，因此血清中GFAP水平可作為評估痛覺異常的指標。

綜上所述，在神經病理性疼痛中，鞘內注射GFAP抗體通過下調脊髓中的GFAP水平可明顯緩解疼痛，并且通過檢測血清中的GFAP水平可對痛覺異常進行預評估。

［1］ Takeda K，Sawamura S，Sekiyama H，et al.Effect of methylprednisolone on neuropathic pain and spinal glial activation in rats［J］.Anesthesiology，2004，100(5):1249－1257.

［2］ Nylen K，Ost M，Csajbok LZ.Increased serum-GFAP in patients with severe traumatic brain injury is related to outcome［J］.J Neurol Sci，2006，240(1－2):85－91.

［3］ Gordh T，Chu H，Sharma HS.Spinal nerve lesion alters blood-spinal cord barrier function and activates astrocytes in the rat［J］.Pain，2006，124(1－2):211－221.

［4］ Decosterd I，Woolf CJ.Spared never injury:an animal model of persistent peripheral neuropathic pain［J］.Pain，2000，87(2):149－158.

［5］ Ghaplan SR，Bach FW，Pogrrel JW，et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw［J］.J Neurosci Meth，1994，53(1):55－63.

［6］ 陳建平，田玉科，王公明.NMDA受體2B亞基模擬表位對慢性神經病理性痛大鼠的鎮痛效應［J］.中華麻醉學雜志，2007，27(12):1100－1103.

［7］ Shi L，Smolders I，Umbrain V，et al.Peripheral inflammation modifies the effect of intrathecal IL-1β on spinal PGE2 production mainly through cyclooxygenase-2 activity.A spinal microdialysis study in freely moving rats［J］.Pain，2006，120(3):307－314.

［8］ Alexander GM，Perreault MJ，Reichenberger ER，et al.Changes in immune and glial markers in the CSF of patients with complex regional pain syndrome［J］.Brain Behav Immun，2007，21(5):668－676.

［9］ Colburn RW，Rickman AJ，Deleo JA.The effect of site and type of nerve injury on spinal glial activation and neuropathic pain behavior［J］.Exp Neurol，1999，157(2):289－304.

［10］ Hassel B，Paulsen RE，Johnsen A，et al.Selective inhibition of glial cell metabolism in vivo by fluorocitrate［J］.Brain Res，1992，576(1):120－124.