不同劑量納洛酮后處理對大鼠腦梗死面積的影響

康 榮，劉 毅，張勤功，鄧麗云，程周軍，蔡 越，朱 毅 (山西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，太原 030013)

雖然缺血后處理的神經(jīng)保護作用已逐漸被研究所證實，但是在實際操作過程中，在非介入條件下對缺血區(qū)實施間斷的再灌注控制存在一定的難度［1］。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，在再灌注開始的同時應用藥物有可能在缺血區(qū)誘發(fā)與缺血后處理類似的后處理現(xiàn)象［2，3］。當前，藥物后處理研究多集中于心肌缺血領(lǐng)域，涉及神經(jīng)保護的藥物后處理研究很少，納洛酮的后處理研究文獻報道不多。納洛酮是μ阿片受體阻斷劑，其是否具有神經(jīng)保護作用尚存在爭議［4，5］，可能與其劑量依賴效應有關(guān)。本研究旨在探討不同劑量納洛酮后處理對大鼠局灶性腦缺血－再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及局灶性腦缺血再灌注模型的制備 成年雄性SD大鼠(北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，批號:SCXK京2006－0008)40只，體重270－330 g，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg體重麻醉，經(jīng)口氣管插管實施機械通氣。采用BL－420生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)連續(xù)監(jiān)測心率(HR)和平均動脈壓(MAP)。采用 Longa法［6］建立局灶性腦缺血再灌注模型，具體操作方法如下:常規(guī)備皮消毒后，取頸正中切口，暴露和游離右側(cè)頸總動脈，通過大鼠右側(cè)頸總動脈置入尼龍線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司)，經(jīng)動脈分叉推送線栓進入頸內(nèi)動脈，遇到明顯阻力表明線栓頭端已阻斷大腦中動脈，阻斷90 min，再灌注24 h。本研究排除操作過程中出現(xiàn)迷走神經(jīng)損傷、缺血再灌注期間MAP不能維持在60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上、尼龍線栓置入失敗或蛛網(wǎng)膜下隙出血、術(shù)后24 h內(nèi)出現(xiàn)感染的大鼠。

1.2 實驗分組及處理 40只大鼠隨機分為4組(每組n=10):生理鹽水對照組(P組)，納洛酮1 mg/kg體重后處理組(N1組)，納洛酮5 mg/kg體重后處理組(N2組)，納洛酮10 mg/kg體重后處理組(N3組)。P組腹腔注射10 ml生理鹽水;N1，N2，N3組于再灌注初始分別腹腔注射納洛酮1，5，10 mg/kg(用生理鹽水稀釋至10 ml)。

1.3 測定指標 于缺血前(基礎狀態(tài))，缺血30，60，90 min，再灌注即刻、30和60 min時記錄HR和MAP;于再灌注2 h和24 h時行神經(jīng)功能障礙評分(NDS)［6］:無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分;輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空時不能伸展左前肢為1分;中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分;重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走時向左側(cè)傾倒為3分;不能自發(fā)行走伴意識障礙為4分。

再灌注24 h時，腹腔注射戊巴比妥鈉90 mg/kg，斷頭取腦，用于測定腦梗死程度。大鼠腦組織－20℃冷凍30 min，沿冠狀位切割成厚度為2 mm的薄片，經(jīng)1%TTC染色20 min，10%甲醛溶液固定24 h。在體視鏡下對每個腦片進行數(shù)碼照相，采用Image-Pro Plus 5.02圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)計算腦梗死面積，腦梗死程度=腦梗死面積÷同側(cè)大腦半球面積×100%。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，其中正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，等級資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，符合方差齊性的計量資料，組內(nèi)和組間比較分別采用重復測量設計的單因素方差分析;方差不齊的計量資料采用F'檢驗法進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與基礎值相比，各組缺血再灌注期間HR和MAP降低(P＜0.05);4組各時點HR和MAP比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

與P組相比，N1，N2組NDS評分差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，N3組降低(P＜0.05);與 N1，N2組相比，N3組NDS評分降低(P＜0.05)，4組兩時間點NDS評分均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

再灌注24 h后4組的腦梗死面積(IS)與同側(cè)大腦半球面積的比值均增高(P＜0.05)，P組(43±6)%，N1組(42±7)%，N2組(41±6)%和 N3組(28 ±6)% 。與P組相比，N1，N2組再灌注24h后的IS與同側(cè)大腦半球面積的比值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，N3組的IS與同側(cè)大腦半球面積的比值減小(P＜0.05);與 N1，N2組比較，N3組再灌注24 h后的IS與同側(cè)大腦半球面積的比值減小(P＜0.05)，見圖1。

表14組各時間點HR和MAP的比較(n=10，±s)Tab 1Comparison of HR and MAP at different time points among 4 groups(n=10，±s)

表14組各時間點HR和MAP的比較(n=10，±s)Tab 1Comparison of HR and MAP at different time points among 4 groups(n=10，±s)

與基礎值相比，*P ＜0.05

缺血30 min 60 min HR(次/min) P 組 374.83 ±25.84 368.50 ±22.99 364.50 ±24.92 358.67 ±23.11* 354.67 ±23.40* 352.33 ±20.72* 350.33 ±24.72指標 組別 基礎值30 min 60 min 90 min再灌注即刻*N1組 370.17 ±14.61 361.67 ±15.04* 356.33 ±12.22*349.50 ±12.91* 344.33 ±12.69* 338.50 ±12.42* 336.00 ±13.49*N2組 375.33 ±16.37 369.00 ±14.83 364.83 ±13.81 360.17 ±13.24* 356.00 ±13.78* 353.33 ±16.01* 350.67 ±14.83*N3組 363.83 ±13.50 360.50 ±14.86 353.67 ±17.33 349.67 ±18.98* 346.00 ±15.68* 341.67 ±15.88* 341.50 ±14.42*MAP(mmHg) P 組 102.67 ±10.61 100.17 ±10.93 98.33 ±10.99* 95.00 ±12.96* 94.17 ±11.96* 93.67 ±12.71* 93.17 ±12.51*N1組 103.83 ±13.92 101.17 ±12.29 99.50 ±13.53 96.33 ±12.58* 94.67 ±12.82* 92.50 ±14.15* 90.17 ±13.57*N2組 99.33 ±14.92 96.83 ±13.98 94.33 ±12.82* 93.50 ±13.13* 90.33 ±11.91* 89.67 ±12.58* 88.33 ±11.45*N3組 103.17 ±13.11 100.50 ±13.66 98.17 ±14.08* 95.17 ±12.72* 93.83 ±13.32* 91.17 ±12.38* 90.33 ±12.86*

表2 四組NDS評分的比較 ［n=10，M(Qu-Ql)］Tab 2 Comparison of neurological deficit scores among 4 groups ［n=10，M(Qu-Ql)］

圖1 再灌注24 h后體視鏡下各組腦組織梗死程度Fig 1 The changes of cerebral infract in 4 groups at 24 h after reperfusion under a stereoscope

3 討論

本研究采用經(jīng)典的Longa法［6］建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，即通過顱外置入線栓造成大腦中動脈缺血，是目前研究局灶性腦缺血再灌注損傷的最常用模型。該模型的主要優(yōu)點是操作成功率高、可重復性好、并發(fā)癥少、一致性腦梗死效果確實，并且能夠更好地反映腦卒中的臨床特點和病理過程。本研究中P組NDS評分和缺血側(cè)腦梗死面積的比較以及缺血對側(cè)和缺血側(cè)腦組織梗死面積的比較均證實該方法可形成一致的局灶性腦缺血再灌注損傷。

Flamm等［7］對急性脊髓損傷患者的研究表明，靜脈注射小劑量納洛酮(0.14－1.43 mg/kg)后體感誘發(fā)電位無任何改善，而靜脈應用大劑量納洛酮(＞5 mg/kg)則可使體感誘發(fā)電位顯著增強。Capdeville等［8］研究表明，靜脈注射納洛酮1 mg/kg未減輕對缺血造成的大鼠腦神經(jīng)損傷，而靜脈注射納洛酮5 mg/kg則可有效逆轉(zhuǎn)神經(jīng)缺損并改善神經(jīng)功能。Feigenbaum等［9］研究表明，納洛酮劑量依賴效應的實質(zhì)是其對多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)細胞內(nèi)外Ca2+流動的影響與劑量相關(guān):在小劑量下(1 mg/kg)，納洛酮可促進Ca2+內(nèi)流，并強化Ca2+內(nèi)流介導的包括多巴胺在內(nèi)的多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放;而在大劑量下(10 mg/kg)，納洛酮則抑制Ca2+內(nèi)流和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。基于以上原因本研究分別設定了納洛酮1 mg/kg，5 mg/kg和10 mg/kg三個劑量組，旨在評價不同劑量納洛酮后處理的神經(jīng)保護作用。

本研究結(jié)果顯示，N3組NDS評分和腦梗死程度降低，表明大劑量納洛酮后處理具有神經(jīng)保護效應，提示納洛酮后處理的神經(jīng)保護效應與其劑量有關(guān)。

本研究表明大劑量納洛酮后處理有神經(jīng)保護效應，但將這一結(jié)果歸結(jié)為納洛酮的受體拮抗作用仍缺乏客觀證據(jù)支持，因為本研究應用的1 mg/kg納洛酮用量(小劑量)足以完全阻斷大鼠體內(nèi)的各型阿片受體［10］。本研究推測為在三種劑量均完全阻斷各型阿片受體的基礎上，導致三組實驗結(jié)果差異的原因為納洛酮后處理的神經(jīng)保護效應可能并不是主要來自其阿片受體拮抗作用，而主要是源自阿片受體外作用。研究已經(jīng)證實納洛酮可通過以下途徑產(chǎn)生神經(jīng)保護效應:①增強細胞膜穩(wěn)定性，抑制鈣超載和神經(jīng)遞質(zhì)釋放(劑量依賴效應)［9］;②降低體內(nèi)自由基水平［11］;③抑制小膠質(zhì)細胞的活化與缺血區(qū)的炎性反應［12］。Feigenbaum 等［9］的研究也表明，由于納洛酮神經(jīng)保護作用的劑量依賴性是雙向的，而其受體拮抗作用是單向的，所以納洛酮的神經(jīng)保護作用可能與其受體拮抗作用無關(guān)［9］。

綜上所述，大劑量納洛酮后處理可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，即納洛酮后處理的神經(jīng)保護作用與其劑量密切相關(guān)。

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