茶多酚對大鼠腎缺血再灌注損傷保護作用實驗研究

李華彬

(四川省雙流縣第二人民醫院腎內科 四川 成都 610213)

腎臟的血流量約是心臟的1/4,因此它是一個高血流的器官,對缺血以及缺氧均較敏感,在臨床上如遇到嚴重燒傷、心臟停跳、失血性休克、呼吸抑制、腎移植術、需暫時阻斷腎血流的手術、毒物中毒及嚴重感染等均可導致腎臟的缺血和缺氧。目前許多研究表明在體內多種臟器缺血后重新恢復血流灌注或氧供,細胞功能代謝障礙及結構破壞較缺血時加重,器官功能將一步惡化,這種情況稱之為缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injure IRI)。同樣腎臟在缺血后重新恢復血液灌注也會出現這一現象。腎臟的缺血再灌注損傷屬急性腎損傷范疇,在臨床上十分常見。急性腎功能損傷導致的急性腎功能衰竭是臨床危重疾病,目前尚無有效防治方法,因此這一病理損傷過程日益引起人們的重視。既往對腎缺血再灌注損傷的防治人們提出了很多技術性和藥物性保護措施,但這些措施均沒有穩定一致的療效。而許多研究僅僅局限于動物階段,應用于人體是否有效還未成定論,所以尋求一種安全、經濟、有效、臨床上易于接受,并能應用于有計劃、長時間缺血之前的預處理方法顯得尤為重要。因此今后的研究如能進一步明確腎臟缺血再灌注損傷的發生機制,把握住保護腎功能的時間規律及最佳治療時間窗,并給予相應處理,則可以最大程度地保護腎功能。茶多酚(TP)是茶葉中的一種主要活性成份,它主要是由兒茶素組成,富含多酚類化合物,有著很強的抗氧化能力和清除ORF的作用[1]。茶多酚的化學組成除酚酸外,主要是以α-苯基苯并吡喃為結構基礎的類黃酮化合物,其中羥基取代基作為質子的供體,使其具有特殊的生理功能：主要表現在抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗菌等方面[2]。本研究在建立大鼠缺血再灌注損傷模型的基礎上,實驗前給予大鼠抗氧化能力很強的茶多酚灌胃預處理,然后在不同時間點上SCr、血清SOD活性、MDA含量;腎組織SOD活性、MDA含量等指標來談討茶多酚預處理對大鼠腎缺血再灌注后的保護作用及其機制。

1 材料與方法

選擇健康近交系清潔級雄性SD大鼠42只。按體重編號,試驗設計為3個大組,A組為假手術組為6只大鼠,B組為單純缺血再灌注組18只大鼠,其中根據恢復再灌注的時間點又分為3個小組,每組6只大鼠。C組也根據恢復再灌注的時間點又分為3個小組,每組6只大鼠,因為是每個小組之間比較,因此實際上可以看為7個小組之間比較。把42只SD大鼠按體重編號后,由隨機數字表產生42個隨機數字,將其除以7,根據余數的不同將所有的動物平均分在7個組中,保證各個小組間具有可比性。所有大鼠分組情況對試驗檢測人員采取盲法。42只雄性SD大鼠適應性喂養1周,術前自由飲食,20%的烏拉坦按1mg/kg腹腔注射麻醉,鉗夾鼠唇無疼痛反應,說明麻醉成功。將大鼠仰臥固定在手術臺上,常規腹部手術區域消毒,用手術剪沿正中線剪開皮膚,沿腹白線剪開腹肌全層,然后應用肝素鹽水2mL(肝素200U/mL)注入腹腔約10min后達到全身肝素化。拉鉤將兩側腹壁拉開,用棉簽將腸管左置,鹽水紗布覆蓋,充分暴露右側腎蒂,用血管鉗夾閉右側腎蒂后,將近端結扎,遠端切除,即所有大鼠均切除右側腎臟。A組大鼠將腸管回納后關閉腹腔,1h后打開腹腔,自腹主動脈取血5mL后,用低溫低速離心機3000轉/min離心后取上清液留待檢測指標;采取左腎組織約0.3g加入冰生理鹽水2.7mL中,用玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿,勻漿同樣用低溫低速離心機3000轉/min離心,留取上清液檢測指標;其余腎組織放入10%的甲醛液中固定作病理切片。即將大鼠處死。B組大鼠切除右腎后將腸管右置,用鹽水紗布覆蓋,用無創動脈夾夾閉左側腎蒂1h后解除夾閉,觀察腎臟顏色,腎臟顏色從黑色變為紅色表示腎臟恢復血液灌注,然后根據再灌注的時間點：0時刻、2h時刻、24h時刻分別處死各組大鼠,每只大鼠只限取一次標本后處死。留取標本方式同A組。C組在試驗前1周給予TP預處理,TP按200mg/kg體重灌胃,灌胃體積為1mL/100g。其余處理同B組。操作過程中向所有動物腹腔中間斷注入37℃生理鹽水30mL/kg(含慶大霉素32萬/L),以保持其血流動力學的穩定以及預防腹腔污染和松鉗后出現的一過性低血容量反應。將血清及腎組織勻漿放入－20℃以下的冰箱保存。在采集足夠的標本后進行指標的檢測。血清肌酐(SCr)應用大型生化儀采用二已酰-肟生化方法檢測;腎組織勻漿及血清超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)采用相應試劑盒檢測。

2 結果

2.1 茶多酚預處理對大鼠急性IRI所致的SCr的影響(表1)

由表1可以看出,IRI組和TP預處理組復流后每個時間點SCr水平高于對照組(P<0.05),其差異具有統計學意義。再灌注后SCr水平均升高。但2h和24h對比(P>0.05),無統計學差異。TP預處理組SCr水平在相應時點低于缺血再灌注組(P<0.05),其差異具有統計學意義。同組內再灌注2h與24h和缺血1h組比較SCr水平升高,其差異具有統計學意義,結果見表2。

2.2 茶多酚預處理對大鼠急性IRI所致的腎組織MDA的變化

2.3 茶多酚預處理對大鼠急性IRI所致的血清MDA的變化(表3)

由表2,3可以看出,IRI組和TP預處理組復流后每個時間點腎組織MDA水平高于對照組(P<0.05),再灌注后腎組織MDA水平均升高,但組內2h和24h無差異性(P>0.05)。IRI組MDA水平在各時間點上高于對照組(P<0.05),TP組預處理組MDA水平也升高,但與IRI組比較,在各時間點上其水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。IRI組和TP預處理組復流后每個時間點血清MDA水平高于對照組(P<0.05),再灌注后血清MDA水平均升高,但組內2h和24h無差異性(P>0.05)。IRI組MDA水平在相應時間點上高于對照組(P<0.05),TP組預處理組MDA水平也升高,但與IRI組比較,其水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。同組內再灌注2h與24h和缺血1h組比較血清MDA及腎組織均漿MDA水平升高,其差異具有統計學意義。結果見表2,3。

表1 血清Cr含量變化情況(n＝42,假手術組n＝6,,umol/L)

表1 血清Cr含量變化情況(n＝42,假手術組n＝6,,umol/L)

注：與假手術組(A組)比較,①P<0.05;C組相應時點與B組比較,②P<0.05;與組內缺血1h即刻采血組比較,③P<0.05

表2 腎組織MDA水平的變化(n＝42,假手術組n＝6,,umol/L)

表2 腎組織MDA水平的變化(n＝42,假手術組n＝6,,umol/L)

注：與假手術組(A組)比較,①P<0.05;C組相應時點與B組比較,②P<0.05;與組內缺血1h即刻采血組比較,③P<0.05

表3 血清MDA水平的變化(n＝42,假手術組n＝6,,umol/L)

表3 血清MDA水平的變化(n＝42,假手術組n＝6,,umol/L)

注：與假手術組(A組)比較,①P<0.05;C組相應時點與B組比較,②P<0.05;與組內缺血1h即刻采血組比較,③P<0.05

2.4 茶多酚預處理對大鼠急性IRI所致的血清SOD的變化

由表4,5可以看出,IRI組和TP預處理組復流后每個時間點腎組織SOD水平低于對照組(P<0.05),再灌注后腎組織SOD水平均降低,但各組內2h和24h無差異性(P>0.05)。IRI組腎組織SOD水平在相應時間點上低于對照組(P<0.05),TP組預處理組SOD水平也降低,但與IRI組比較,其水平升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。IRI組和TP組預處理組復流后每個時間點血清SOD水平和對照組比較均降低,但2h和24h無差異性(P>0.05)。IRI組血清SOD水平在相應時間點上低于對照組(P<0.05),TP預處理組血清SOD水平也降低,但與IRI組比較,相應時間點上血清SOD水平均有升高,差異具有統計學意義(P<0.05),與對照組比較無差異(P>0.05)。結果見表4,5。

3 討論

3.1 腎臟缺血再灌注損失發生的機制

腎IRI的發生機制尚未完全闡明,但許多學說和理論在臨床和基礎實驗中已基本得到證實。發生機制主要為大量氧自由基(OFR)形成、白細胞浸潤、細胞內鈣超載及能量代謝障礙等。急性腎缺血再灌注損傷和保護作用是一個十分復雜的過程,OFR在缺血再灌注損傷中起了重要作用,并得到公認。正常情況下,腎臟的抗氧化能力與不斷產生的OFR的氧化能力之間保持著相對動態平衡,不會引起組織細胞的損傷。如果OFR的產生異常增多,或腎臟的抗氧化能力下降,就將導致腎臟組織細胞的損傷。腎臟的氧供應十分豐富,OFR產生的機會相對較多,是機體內最容易產生OFR的器官之一。腎內OFR來源十分廣泛,其中腎小球內皮細胞發生缺血再灌注過程是OFR產生的途徑之一。機體同時也存在清除OFR的酶系統,一般情況下,其產生與清除處于平衡狀態。再灌注時OFR大量產生,而酶系統由于缺血缺氧處于抑制狀態無法清除OFR,使得其大量堆積。OFR具有強大的生物活性,它攻擊生物膜發生脂質過氧化發應,可以損傷生物膜,使它們失去正常的生物結構和功能,引起細胞功能和能量障礙進而引發一系列的病理改變[3]。同時,過氧化脂質最終分解為丙二醛(MDA),MDA也具有細胞毒性作用,從而加劇IRI。細胞內鈣超負荷通過3個環節導致細胞凋亡：激活磷脂酶;直接和間接損害膜的通透性;破壞細胞骨架連接。早期研究證實腎缺血再灌注損傷時可出現Ca2+大量內流,腎缺血后,腎小管上皮細胞內Ca2+濃度明顯升高,從而使細胞內磷脂酶活力增加,更多磷脂酶分解為游離脂肪酸,另外Ca2+濃度增加使Ca2+-ATP酶活力增加,從而消耗了更多ATP。Ca2+本身又可通過OFR途徑造成組織損傷。鈣超載與OFR的產生是腎IRI的重要因素,二者相互影響,協同作用,導致IRI加重。既往認為生理劑量一氧化氮(NO)對腎臟有保護作用,NO通過生理性調節血管緊張性,抑制血小板聚集,減少白細胞粘附于血管內皮細胞,清除OFR,維持血管滲透壓,抑制平滑肌細胞增殖,免疫防御,刺激內皮細胞再生等作用保護腎臟。但部分研究者認為NO對缺血再灌注后的腎臟主要起損害作用,Yin等[4]認為腎缺血/再灌注早期就有大量活性氧產生,與此同時NO大量出現,有可能生成毒性更強的過氧亞硝酸陰離子(ONOO-),研究證實腎缺血再灌注時腎小管上皮細胞的損傷是由ONOO-所致,ONOO-具有較大的細胞毒性對移植器官造成損傷。另外還有白細胞浸潤、細胞因子參與、粘附分子及中性粒細胞的聚集、能量代謝障礙等也參與腎IRI的發生機制。

3.2 腎臟缺血再灌注損失時腎臟的變化

腎移植中的IRI,近端腎小管表現為細胞變性、壞死、脫落、管型形成、充血以及多形核中性粒細胞的浸潤,遠端腎小管表現為凋亡。腎小球組織則出現中性粒細胞的大量聚積,這些中性粒細胞與腎血管內皮相互作用,產生炎癥反應,使腎血管阻力增加,而且腎缺血缺氧時血管緊張素Ⅱ、內皮素等縮血管物質生成釋放增多,引起腎血管收縮,產生再灌注時無復流現象進一步加重腎小球灌注不良,導致腎小球結構功能的破壞[5]。嚴重的IRI可使移植腎功能延遲恢復、促進急性排斥的發生。而且,作為一個主要的非抗原依賴性因素可直接導致慢性移植腎病,對短期及長期移植腎功能均有不良影響。

表4 血清SOD水平的變化(n=42,假手術組n＝6,,umol/L)

表4 血清SOD水平的變化(n=42,假手術組n＝6,,umol/L)

注：與假手術組(A組)比較,①P<0.05;C組相應時點與B組比較,②P<0.05;與組內缺血1h即刻采血組比較,③P<0.05

表5 腎組織SOD水平的變化(n＝42,假手術組n＝6,umol/L)

3.3 茶多酚預處理對大鼠缺血再灌注損傷所致SCr影響

IRI時腎小管表現為細胞變性、壞死、脫落、管型形成、充血以及多形核中性粒細胞的浸潤;腎小球組織則出現中性粒細胞的大量聚積,同時大量OFR攻擊生物膜,使它們失去正常的生物結構和功能,引起細胞功能和能量障礙,這些均導致腎臟功能受損,我們知道只要30%腎單位的功能存在SCr就可以維持正常水平,而SCr水平顯著升高意味著存在嚴重的腎功能損傷。本研究顯示,缺血再灌注后SCr水平明顯升高,TP預處理組升高較單純缺血再灌注組為輕,差異有統計學意義,說明TP保護了缺血再灌注后的腎臟,減少了損傷。腎IRI主要影響外髓質和皮髓交界處的近端腎小管,因為該部位對缺血、缺氧最敏感。腎小管上皮細胞正常功能依賴于其結構的完整性,腎臟IRI可導致大量的腎小管上皮細胞壞死,損傷嚴重時還出現基底膜斷裂,腎小管塌陷,導致腎功能急劇下降,最后引起急性腎功能衰竭。傳統的觀點[6]認為腎小管上皮細胞具有強大的增植修復能力,急性腎臟缺血再灌注損傷可以完全逆轉,不留有慢性損害。但腎小管上皮細胞增植修復能力是有限的,它依賴于存活的小管細胞的數目和小管基底膜的完整性,如果損傷超過了一定限度,病理性的修復難以避免。那么許多研究基于這樣的機理,希望能夠在再灌注時盡量減少損傷,盡量保護腎小管的細胞數目,這樣在將來的修復過程中能夠最大程度的保護移植腎臟的功能。本研究結果顯示TP對腎IRI具有保護作用,其病理切片我們可以看到TP預處理組主要表現為腎小管腫脹為主,個別呈現壞死樣改變,腎間質水腫、充血、炎性細胞浸潤不明顯,其腎小管基本保持完整。因而其SCr水平相比無保護組要低,充分體現了TP對缺血再灌注腎臟的保護作用。而TP預處理的最佳方案如最佳治療時機、最佳治療劑量等以及其對腎臟的各種保護機制的內在聯系還有待于進一步研究。

3.4 TP對大鼠缺血再灌注損傷所致血清及腎組織SOD和MDA水平的影響

SOD是體內清除OFR的重要酶系之一,是抗氧化指標之一,其作用底物主要是OFR中超氧陰離子O2-。在生物體內SOD將O2-歧化為H2O2,H2O2在過氧化氫酶和過氧化物酶的作用下變為H2O,從而解除O2-對生物體細胞損傷,起到保護作用。由于缺血再灌注時產生了大量的OFR,而OFR具有強大的氧化活性,對幾乎所有的生物分子都有損傷,尤其對脂質最為敏感。OFR與細胞膜、線粒體膜、溶體膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化作用,產生的過氧化脂質(LPO)可以損傷生物膜。過氧化脂質最終產物為丙二醛(MDA),MDA也具有細胞毒性作用,從而加劇IRI。因此體內如SOD活性增加就會增加對抗OFR的作用,使得脂質過氧化反應減少,SOD活力的測定與MOD含量的測定相配和,SOD活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力,而MOD含量的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。因此如若血清中的SOD活性增加,MDA含量減少可以反映對缺血再灌注臟器的保護作用。研究表明TP是一種強抗氧化劑。TP對食用油脂的抗氧化能力為維生素E、丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)的3～9倍[7]。奧田拓男[8]以大白鼠肝線粒體和微粒體模擬體內脂質過氧化試驗,結果TP的抑制效果比維生素C和維生素E高18倍和16倍。TP是茶葉中的一種主要活性成份,它是由茶葉中提取的黃烷醇類、黃烷雙醇類、類黃酮類和酚酸類四類化合物的總稱,有著獨特的抗氧化效果。TP是一類含有多酚羥基的化學物質,其抗氧化特性通過下述幾種途徑體現。首先,TP的酚羥基能作為供氫體,提供質子H+,將單線態氧還原成活性較低的三線態氧,減少OFR產生的可能性;并能奪取過氧化過程中產生的脂質過氧化自由基,生成活性較低的多酚自由基,打斷自由基氧化鏈反應,有效清除體內自由基。比較TP和幾種常用的抗氧化劑,如維生素E、維生素C、迷迭香(RA)、姜黃素(Cur),TP具有的抗氧化、抗誘變、神經保護、抑制腫瘤發生、降血脂和心血管系統中對活性氧自由基的清除情況,可以看到TP對活性氧自由基的清除能力明顯大于常用的抗氧化劑。它同時可以作用于自由基有關的酶系。目前對于腎臟應用TP預處理研究其對IRI保護作用的研究大多數只限于動物試驗階段,人類的腎臟是否存在TP預處理的效應,臨床上研究報道很少。但有研究證實TP是非常安全的,至今在茶葉中還未發現具有一定毒性的單體酚類化合物,例如兒茶酚,所以TP對人體是絕對安全的。如果TP對人體確有有效的抗氧化作用,那么臨床上存在很多合適的病例,如果這些病例能從中獲益對臨床治療將是很大的貢獻。特別是腎臟移植手術,就可以提前給以TP預處理。本次試驗筆者只觀察了一種劑量的TP預處理方案,是否是TP的理想治療劑量還需要進一步的研究。

綜上所述,TP預處理對腎臟IRI有保護作用,對防治IRI具有重要的研究意義,并且為加強腎臟移植的保護提供理論依據。

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