莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經元損傷的影響

王文,許棟明,相婕,李蕾,王培昌,艾厚喜,張麗,李林

缺血性腦損傷是危害人類健康的三大疾病之一。我國居民第三次死因調查結果顯示,腦血管病已成為我國第1位的死亡原因,死亡率高于歐美國家4～5倍,目前臨床上缺少有效的腦保護藥。中藥治療腦血管病有確切的臨床療效。我們從中藥山茱萸篩選到有效成分莫諾苷,前期細胞試驗表明,對神經細胞SY5Y具有抑制過氧化氫損傷、抑制細胞凋亡、鈣超載等作用[1-9],有提高局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力的作用[10]。本試驗研究莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層超氧化物歧化酶及神經細胞數量的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備,HPLC分析純度大于98.5%。維生素E(VE):北京雙鶴藥業。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒:南京建成生物工程研究所(批號:20081102)。其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗動物分組及給藥 72只SPF級Wistar雄性成年大鼠,體重260～280 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證編號:SCXK(京)2007-0001。隨機分為假手術組,模型組,莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)劑量組和維生素E組(35 mg/kg),每組12只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術后一半動物連續灌胃給藥3 d,另一半連續灌胃給藥7 d,每天給藥1次。

1.3 模型制備 局灶性腦缺血再灌注模型采用改良Zea Longa線栓法[3]制備。大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/kg腹腔注射麻醉,仰臥位固定于鼠板上,頸部正中切口,鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈,結扎頸外動脈和頸總動脈的近心端,動脈夾與頸總動脈近心端之間結扎一道縫合線,不扎緊。在頸總動脈接近頸外動脈和頸內動脈分叉處用眼科剪作一斜行細切口,將直徑為0.26 mm的尼龍線插入,稍扎緊縫合線,推動尼龍線進入頸內動脈,進入距頸外動脈和頸內動脈分叉處約2 cm時,會有阻擋感,說明栓線已越過大腦中動脈,到達大腦前動脈的起始部。記錄栓塞開始時間,結扎頸總動脈上端。縫合肌肉、皮膚。栓塞后2 h,若此時大鼠已蘇醒則需要再次將大鼠麻醉,并拔出尼龍線。假手術組的大鼠除不插入尼龍線外,其他操作與手術組相同。

1.4 模型成功及評價標準 參照 Longa及Bederon的5分制評分方法[3-4]對實驗動物的神經行為學進行評分。0分:無神經系統損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:向左側轉圈;3分:向對側傾斜;4分:不能自發行走,意識喪失。將0分、1分及4分大鼠剔除并補充各組設計所需大鼠數量。

1.5 SOD測定 腦缺血再灌注后3 d迅速斷頭取腦,冰生理鹽水快速漂洗,徹底去除標本表面血液后,于冰盤上分離患側腦皮層組織。將大鼠患側腦皮層組織在電子天平上稱重后,用高速電動勻漿器在低溫下制成10%組織勻漿液。置低溫高速離心機內,12000 r/min離心30 min。SOD檢測按照試劑盒說明書進行,并按試劑盒提供的公式進行計算。

1.6 Nissl染色 再灌注7 d大鼠用體積分數為0.04的甲醛行心臟灌注,取腦組織行石蠟包埋。組織切片經脫蠟、逐級乙醇脫水及水洗后,加入緩沖亞甲蘭染液10 min,0.2 M乙酸鹽緩沖液(pH=4.6)分色2 min。陽性染色者胞核淡染,胞質呈藍色,即存活的神經元。

2 結果

2.1 SOD 模型組皮層SOD活性降低;與模型組相比,莫諾苷大劑量和VE組SOD活性顯著升高(P＜0.01,圖 1)。

2.2 腦神經元 模型組神經元數量明顯下降;與模型組比較,莫諾苷各組能明顯提高神經元數;VE組與模型組無顯著性差異(圖2)。

3 討論

缺血性腦血管病具有發病率高、死亡率高、致殘率高的特點。尋找有效的預防措施以減少發病率、有效的腦保護措施以減少死亡率以及有效的再生修復措施以減少其致殘率和致殘程度是研究的關鍵。

缺血性腦損傷在急性期主要是由于能量障礙引起氧化應急、鈣超載、興奮性氨基酸毒性,造成腦損傷。在這一階段,抗氧化、抑制鈣超載和興奮性氨基酸毒性是治療的關鍵問題。人體抗氧化主要有兩種方式,小分子抗氧化物質和抗氧化酶,其中由于氧化應激而誘導產生的抗氧化酶在這個過程中起著重要作用,它是體內抗氧化能力的重要反應。缺血再灌注3 d基本上能夠反映藥物在急性期抗氧化能力。本研究顯示,大劑量莫諾苷和經典的抗氧化劑VE一樣,表現出很好的抗氧化活性,顯示有良好的應用前景。

腦缺血/再灌注損傷在急性期另外一個病理過程是引起神經元的死亡和凋亡,造成神經元大量減少,造成神經功能障礙。本研究顯示,大鼠腦缺血/再灌注后,口服莫諾苷7 d,可以抑制神經元數量的減少,有神經保護作用;而VE沒有抑制神經元減少的作用,表明莫諾苷在抑制氧化應激外,另有其他機理產生神經保護作用,值得進一步探討。

[1]Wang W,Sun F L,An Y,et al.Morroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity[J].Eur J Pharmacol,2009,613:19-23.

[2]Wang W,Huang WT,Li L,et al.Morroniside prevents peroxideinduced apoptosis by induction of endogenous g lutathione in human neuroblastoma cell[J].Cell M ol Neurobiol,2008,28(2):293-305.

[3]王文,孫芳玲,安宜,等.莫諾苷抑制過氧化氫誘導的 SH-SY5Y神經細胞凋亡[J].中國康復理論與實踐,2009,15(5):428-430.

[4]王文,孫芳玲,安宜,等.莫諾苷抑制過氧化氫誘導的 SH-SY5Y神經細胞鈣超載和細胞毒[J].中國康復理論與實踐,2009,15(3):201-202.

[5]孫芳玲,王文,安宜,等.莫諾苷抑制過氧化氫誘導的神經細胞損傷作用[J].中國藥物與臨床,2008,8(11):843-845.

[6]艾厚喜,王文,孫芳玲,等.莫諾苷抑制H2O2誘導的神經細胞凋亡[J].中國中藥雜志,2008,33(9):2109-2112.

[7]王文,黃文婷,艾厚喜,等.中藥誘導腦成體神經干細胞的增殖分化[J].中國康復理論與實踐,2007,13(1):26-29.

[8]黃文婷,王文,艾厚喜,等.莫諾苷對SH-SY5Y神經細胞生長的影響及對過氧化氫誘導損傷的保護[J].中國康復理論與實踐,2007,13(9):839-841.

[9]艾厚喜,黃文婷,王文,等.莫諾苷抑制過氧化氫誘導的SH-SY5Y神經細胞氧化損傷[J].中國康復理論與實踐,2007,13(11):1023-1025.

[10]艾厚喜,李蕾,許棟明,等.莫諾苷對局灶性腦缺血在灌注大鼠皮層總抗氧化能力的影響[J].中國康復理論與實踐,2009,15(9):833-834.