局部亞低溫對膽紅素腦病仔兔腦基底節中多巴胺及5-羥色胺的影響

王麗梅,郝艷秋,石麗宏

膽紅素腦病是游離膽紅素通過血腦屏障進入腦組織,導致神經細胞中毒變性,出現神經系統異常表現[1]。膽紅素腦病時,一些單胺類神經遞質如多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)代謝紊亂,產生肌張力改變及運動協調障礙等一系列臨床癥狀,是導致小兒腦性癱瘓的原因之一,可造成手足徐動型腦癱,視聽障礙、智力障礙等嚴重神經系統后遺癥。本研究通過監測亞低溫治療不同時間窗內膽紅素腦病仔兔腦基底節中DA、5-HT含量變化,探討局部亞低溫對膽紅素腦病的神經治療及保護作用,為臨床新生兒膽紅素腦病亞低溫治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用純系新西蘭仔兔112只,兔齡2～5 d,體重60～ 100 g,自然分娩,雌雄不拘,購自哈爾濱醫科大學實驗動物中心。將仔兔隨機分為4組:常溫對照組(NC):肛溫=37℃,n=28;亞低溫對照組(HC):肛溫 =33.5℃,n=28;常溫膽紅素腦病組(NB):肛溫=37℃,n=28;亞低溫膽紅素腦病組(HB):肛溫=33.5℃,n=28。4組仔兔又隨機分為0、6 h 、12 h 、24 h 組,每組各 7 只 。

1.1.2 試劑與儀器 膽紅素(C33H36N4O6,分子量584.7):美國Sigma公司;DA、5-HT測試盒;二乙酸熒光素及國產分析純或化學純等。儀器有HDB-01貼敷式局部亞低溫腦保護儀:哈爾濱工業大學熱工教研室研制;SL24型針型點溫傳感器(?=1.15 mm);熒光分光光度計;高效液相色譜儀等。

1.2 方法

1.2.1 造模 向NB組和HB組仔兔腹腔注射膽紅素200 μ g/g,NC組和HC組腹腔注射生理鹽水1 ml。給藥后恒溫、恒濕、避光環境中配方乳哺育4 h。仔細觀察仔兔神經行為變化。

1.2.2 亞低溫治療 HB和HC組于造模結束后立即應用HDB-01貼敷式局部亞低溫腦保護儀治療,降溫帽置于仔兔頭部,三維靶點降溫,設定制冷溫度為8℃,腦內制冷溫度33.0℃[3],腦溫過低采用60 W白熾燈加熱,過高用冰袋降溫,亞低溫時間分別為0、6 h、12 h、24 h。停止降溫后自然復溫。觀察治療期間仔兔的一般狀態。

1.2.3 取材 于相應時間點將仔兔用10%水合氯醛0.2 ml/100 g腹腔注射麻醉,經左心室插管入主動脈,生理鹽水200 ml灌注,4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2;4℃)100 ml灌注固定。仔兔斷頭,冰盤下取出腦組織,剝離腦膜及大血管,以冷生理鹽水沖洗數次,自腦組織矢狀縫切開,一側立即于-20℃凍存,用于測定腦基底節區DA、5-HT及膽紅素含量。

1.3 5 -H T、DA及膽紅素測定 腦基底節區組織勻漿,按試劑盒說明操作,采用熒光分光光度計在激發光波長365 nm、發射波長480 nm下測樣品熒光強度,測定5-HT含量,在波長310/370 nm下測DA含量。膽紅素采用重氮檢測法:10倍體積冰醋酸勻漿,1500 r/min離心5 min,取上清液,再加等體積丙酮混勻,抽提、離心取上清液。各管分別加入重氮試劑,5 min后于波長540 nm下讀取吸光度。

2 結果

2.1 神經行為觀察 NC和HC組仔兔于麻醉蘇醒后活動正常,吸吮有力,無異常神經行為活動,對外界刺激有靈敏的逃避反應。NB組仔兔造模結束后表現為興奮、躁動和易激惹;6 h后出現俯伏,運動減少,對刺激反應遲鈍,動作遲緩,平衡差,轉圈,翻滾;12 h出現角弓反張,顫動,抽搐,不能步行;24 h出現四肢不能活動;2例死亡。HB組在亞低溫治療后12 h出現俯伏,運動減少,對刺激反應遲鈍,動作遲緩,平衡差,轉圈,翻滾;24 h對刺激反應較前靈敏,運動增加;未出現角弓反張,顫動,抽搐及不能步行;無死亡。

2.2 DA及5-HT變化 NB和HB組仔兔腦基底節中DA及5-HT含量于造模結束后與NC及HC組比較均明顯降低(P＜0.01),兩組間相比無顯著性差異(P＞0.05)。HB組于治療6 h、12 h、24 h時DA及5-HT含量與NB組比較均明顯升高(P＜0.01),于24 h接近正常。見表 1、表2。

表1 不同時間仔兔腦基底節中DA含量(nmol/g)

2.3 膽紅素變化 NB及HB組仔兔腦基底節中膽紅素于造模結束后與NC及HC組比較均明顯增高(P＜0.01),兩組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。HB組經亞低溫治療6 h、12 h、24 h后,膽紅素含量明顯降低(P＜0.01)。見表3。

NB組腦組織中膽紅素含量與DA含量高度負相關(r=-0.99,P＜0.01)。

表2 不同時間仔兔腦基底節中5-HT含量(nmol/g)

表3 不同時間仔兔腦基底節中膽紅素含量(μ g/g)

3 討論

近年來國內外一些研究證明,單胺類神經遞質的代謝紊亂在膽紅素腦病神經元損傷,尤其是遲發性神經元死亡中起重要作用[4]。在中樞神經系統內,單胺類神經遞質的變化處于相對平衡狀態,膽紅素的神經毒性可以打破這種平衡狀態。

Grojeans等發現,膽紅素腦病時,游離膽紅素使線粒體功能受損[5],細胞處于氧化應激狀態,產生過多的氧自由基[6];氧自由基可隨腦血流進入基底核區,對多巴胺及非多巴胺能神經元產生神經毒性作用,在此基礎上激活小膠質細胞、啟動炎癥反應,導致神經營養因子的缺乏,最終引起進行性神經元變性死亡,造成多巴胺能神經元受損死亡[7]。而在殘存的多巴胺能神經元中,因代償作用使多巴胺的合成、代謝和更新的速率都加快,產生更多的氧自由基進一步加重氧化應激,增加多巴胺能神經元的損傷。當黑質多巴胺能神經元變性超過80%時,就會出現錐體外系的失調,失去對運動的自控能力[4]。

另外,中樞神經系統存在著5-HT能神經元。膽紅素腦病時,腦干中縫核5-HT神經元變性、脫失,導致紋狀體中5-HT減少及5-HT-組織胺系統失衡,使組織胺興奮作用增強而產生臨床癥狀,也表現為錐體外系癥狀。

動物實驗證實,亞低溫在海馬、腦皮質、基底節、丘腦等處具有明顯神經細胞保護作用[3]。近年來大量動物實驗及臨床研究表明,缺氧缺血后6 h內給予持續72 h的亞低溫治療,神經保護作用顯著[8]。亞低溫治療有全身亞低溫及局部亞低溫,由于兒科尤其是新生兒涉及保溫,所以多選擇局部亞低溫。目前亞低溫治療新生兒疾病尚處于早期臨床研究階段。周文浩等對24例中重度窒息足月新生兒進行頭部亞低溫治療并對其安全性評價,證實亞低溫治療將體溫維持在34.5℃左右,不會加重窒息新生兒心、肝、腎及血液、代謝等功能損害。本研究采用貼敷式局部亞低溫治療儀,所有實驗動物均未出現硬腫、呼吸暫停等,動物吸吮能力及進奶量在各組間未見明顯的差別,各組仔兔體重降低也不明顯,從而也證明亞低溫治療的安全性。

文香淑等對單胺類神經遞質在膽紅素腦病動物體內的含量變化進行研究,證明膽紅素腦病時,基底神經核區DA、5-HT含量下降,海馬、腦干、皮層均有輕度降低,腦干區NE下降,海馬、皮層、基底核NE均有下降趨勢,但無統計學意義;基底核DA、5-HT含量與腦干NE含量呈線性正相關,基底節區DA含量與5-HT含量線性正相關,表明膽紅素神經毒性可使基底節區DA、5-H T能神經元與腦干NE能神經元同時受到破壞,影響單胺類神經遞質的合成、釋放與攝取[9]。與本研究結論相似。本研究結果還顯示,未經治療的膽紅素腦病腦組織內膽紅素逐漸升高,并與腦組織DA負相關;表現為膽紅素濃度依賴性和作用時間依賴性[10]。這也為神經行為學變化所證實。

本研究顯示,貼敷式局部亞低溫可以減輕膽紅素對腦組織的神經毒性,減輕腦組織尤其是基底神經核區DA、5-H T能神經元的損傷,對腦組織具有保護作用,并可改善仔兔的神經行為異常。亞低溫時間越長,效果越好。

目前認為,亞低溫治療時間越早預后越好,一般主張在發病后6 h內使用;使用亞低溫治療時間可根據病情維持2～5 d,一般主張不超過7 d。但國內也有報道因病情嚴重可應用14 d[8]。

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