紫菜薹BcMF4基因的克隆及其RNAi植物表達載體的構建

劉樂承，林小芳 (長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

紫菜薹BcMF4基因的克隆及其RNAi植物表達載體的構建

劉樂承，林小芳
(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

根據普通白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis,syn.B.rapassp.chinensis)雄性不育相關基因BcMF4序列設計一對特異引物，從紫菜薹(B.campestrisssp.chinensisvar.purpuraria)中克隆出了大小為710 bpBcMF4基因片段。采用Gateway技術，構建了BcMF4基因RNA干涉(RNA interference,RNAi)植物表達載體。為下一步通過沉默BcMF4基因，明確其對紫菜薹花粉發育和雄性不育的影響奠定了基礎。

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)；BcMF4基因；克隆；RNAi(RNA interference)；表達載體

BcMF4(BrassicacampestrisMale Fertility 4)基因是從普通白菜(B.campestrisssp.chinensisvar.communisTsenetLee)核雄性不育兩用系中分離得到的一個雄性不育相關的隱性基因[1]。目前，已經從十字花科植物11個物種中克隆出了BcMF4的同源基因[2]，而且已經證明，在菜心(B.campestrisssp.chinensisvar.parachinensis(Bailey) TsenetLee)、擬南芥(Arabidopsis)中，BcMF4與花粉發育有著密切關系[3,4]。然而，至今還沒從紫菜薹(B.campestrisssp.chinensisvar.purpuraria)克隆出BcMF4的同源基因。紫菜薹是十字花科蕓薹屬作物，原產我國，營養價值極高[5]。紫菜薹早熟品種和中晚熟品種分別于國慶、元旦、春節前后大量上市，深受大眾的喜愛[6]。本研究擬從紫菜薹中克隆出BcMF4后，采用Gateway技術構建其RNA干涉(RNA interference,RNAi)[7]植物表達載體，旨在為下一步通過沉默該基因明確其對紫菜薹雄性不育的影響及分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

田間種植‘十月鮮’紫菜薹，開花期取2.5 mm以上的花蕾[2～4]，立即投入液氮中，帶回實驗室-75 ℃保存備用。

T4-DNA連接酶、pGEM-T-easy-vector 購自Promega公司；1 kb DNA Ladder Marker、100-bp DNA Ladder和VITGENE DNA回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA Polymerase購自Fermentas公司；B型小量質粒快速提取試劑盒購自背景博大泰恒生物技術有限公司；Gateway?BP ClonaseTMII購自Invitrogen公司。PCR引物委托湖北省武漢鼎國生物技術有限公司合成。IPTG、X-gal、氨芐青霉素、利福平、鏈霉素等購自北京索萊寶科技有限公司。常規試劑均為進口或國產分析純。

大腸桿菌(E.coli)DH5a菌株、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404工程菌株由長江大學許峰博士惠贈；pHGRV質粒為華中農業大學葉志彪教授惠贈。

1.2 目的片段的克隆

稱取1.0～1.5 g紫菜薹花蕾，采用CTAB法[8]提取DNA，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢查、分子檢測儀檢測質量。根據文獻[4]設計1對引物(B4-1：5’-GCT GGATCC ATC AAG AAG TCC CTT AAC AAC C-3’；B4-2：5’-GCT TCTAGA ACA TCA TCG AAG CAT CAC C-3’)，以提取的紫菜薹DNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，63.6 ℃退火45 s，72 ℃延長45 s，共30個循環；72 ℃延長10 min；4 ℃保存；PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，用手術刀切下含目的片段的膠塊，采用VITGENE DNA膠回收試劑盒進行回收。取適量的回收DNA與50 ng pGEMRR-T-Easyv-ector在T4連接酶作用下連接。將連接產物轉化大腸桿菌DH5a菌株感受態細胞。在LB/Amp/IPTG/X-gal篩選平板上篩選重組子，挑選白色菌落經LB液體培養后，用B型小量質粒快速提取試劑盒提取質粒DNA(按說明書進行)。取適量質粒DNA為模板，以B4-1、B4-2為引物，進行PCR擴增鑒定。

1.3 RNAi表達載體的構建

以帶有目的基因片段的重組質粒為模板，用aBttI+和aBttII+進行第一輪PCR擴增(50 μL PCR反應液中含有引物10 pmol/L，擴增條件為：95 ℃ 2 min后，94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，5個循環)，取10 μL反應物至含有40 pmol/L aBtt 通用引物的40 μL PCR反應液中進行第二輪擴增(95 ℃ 1 min后，94 ℃ 15 s，45 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，5個循環；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，15個循環，68 ℃ 延伸5 min)，PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠分離檢測，回收目的片段。在5 μL BP緩沖液中，依次加入100 ng純化的PCR產物和100 ng帶有attP位點的pHGRV質粒DNA，混勻，加入4 μL BP Clonase，25 ℃反應過夜。加入1 μL蛋白酶K，37 ℃ 10 min終止反應。取反應物熱擊法轉化大腸桿菌DH5a，Str 50 mg/L的LB固體平板篩選陽性克隆。以pHGRV上35S與Intron序列為引物對陽性克隆進行PCR檢測[9]。提取陽性重組子質粒，CaCl2轉化法轉化農桿菌LBA4404[10]，在含Rif 50 mg/L、Str 80 mg/L的LB平板上篩選陽性克隆，菌落PCR檢測驗證，定名為pHGRV-B4。

2 結果與分析

2.1 目的片段的獲得

提取的紫菜薹基因組DNA經瓊脂糖凝膠電泳(圖1)檢測后，分子檢測儀器檢測發現DNA含量為1.86 mg/mL，D260=0.186，D280=0.091，D280/D260=0.49，表明提取的紫菜薹基因組DNA質量較好。以B4-1、B4-2為引物對其進行PCR擴增，得到的目的片段為單一條帶，大小為710 bp左右(圖2)，與預期吻合。連接到pGEM-T-Easy-vector載體上后，PCR驗證大小為710 bp左右；陽性克隆測序結果證實所擴增的條帶為BcMF4基因片段。

M為Marker；A、B為DNA片段圖1 紫菜薹基因組DNA電泳圖Figure1 Electrophoresisofpurplecai?taigenomeDNAM為Marker；A為擴增的BcMF4片段圖2 BcMF4基因PCR擴增產物電泳圖Figure2 ElectrophoresisofBcMF4fragmentofPCRamplification

2.2 RNAi表達載體的獲得

M為Marker;A、B為PCR擴增片段圖3 RNAi表達載體的PCR檢測電泳圖Figure 3 Electrophoresis of RNAi expression vector by PCR detection

經過兩輪PCR反應獲得帶有aBtt位點的目的基因BcMF4基因片段，然后在BP Clonase作用下，與載體pHGRV上的attP位點發生重組，將目的基因片段整合到pHGRV上，最終獲得了帶有反向重組BcMF4基因的RNAi植物表達載體(圖3)。

3 討論

蕓薹屬作物是雜種優勢利用最為普遍的一類作物，而雄性不育系是白菜類等蕓薹屬作物雜種優勢利用的最理想方式，因而其雄性不育的選育及其應用基礎的研究深受人們重視。隨著分子生物學實驗手段日臻完善，從分子水平上闡明蕓薹屬植物雄性不育的機理已成為可能。從雄性不育的遺傳基礎著手，了解花粉發育相關的基因以及抑制花粉發育的基因，是揭示雄性不育產生的機理的有效途徑。但迄今為止，從蕓薹屬植物中分離的花粉、花藥特異表達基因為數不太多，且多數基因功能尚不清楚。從普通白菜核雄性不育兩用系中成功分離得到雄性不育相關的隱性基因BcMF4后，已經從十字花科植物11個物種中克隆出了同源基因，而且已經證明，在擬南芥、菜心中與花粉發育有著密切關系[3,4]。本研究從紫菜薹克隆出了BcMF4基因的同源片段，為下一步研究奠定了基礎。當然，還需通過RACE等方法克隆出BcMF4基因的全序列，以進一步證實所克隆片段的正確性。

RNAi現象普遍存在于植物和動物中，這一現象一經發現馬上就引起了人們的高度重視，并迅速發展成為一種強大的“基因沉默”技術，廣泛應用于各種生物的基因功能鑒定和功能基因表達調控領域[11]。RNAi的關鍵在于表達載體的構建。但是，以往RNAi植物表達載體的構建十分繁瑣，耗時費錢[3,4]。本研究采用Gateway技術，不再需要使用限制性內切酶和連接酶，操作簡便，反應條件易于控制，陽性克隆通過PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳即可檢測，獲得的表達載體能直接用于農桿菌介導的植物轉化，從而為下一步通過沉默BcMF4基因，明確其對紫菜薹花粉發育和雄性不育的影響奠定了基礎。

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2010-10-16

湖北省教育廳重點項目(2007ABA386)

劉樂承(1964-)，男，湖北洪湖市人，農學博士，教授，主要從事園藝植物遺傳育種的教學與研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.04.013

Q785

A

1673-1409(2010)04-S044-03