幾種激素對結球甘藍花藥愈傷組織誘導的影響

王神云，李建斌，王 紅，萬雁玲，丁萬霞 (江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇 南京210014)

幾種激素對結球甘藍花藥愈傷組織誘導的影響

王神云，李建斌，王 紅，萬雁玲，丁萬霞
(江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇 南京210014)

以結球甘藍(Brassicaoleraceavar.capitata)2個基因型475和476為材料，研究了KT、2,4-D、6-BA對結球甘藍花藥愈傷組織誘導的影響。結果表明，2,4-D在結球甘藍花藥誘導培養中作用最大，KT次之，而6-BA的作用基本可以忽略。激素互作效應中，2,4-D對結球甘藍花藥誘導培養作用基本不受6-BA的影響，2,4-D與KT的互作效應顯著，KT與6-BA的互作效應相對復雜。激素組合中以2.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L KT(H7處理)的愈傷組織誘導率最高。

結球甘藍(Brassicaoleraceavar.capitata)；花藥培養； 激素；愈傷組織；誘導率

自Guha等[1]1964年首次從毛曼陀羅(Daturainoxia)建立花藥培養以來，該技術一直受到遺傳育種界的關注，近年來進展很快，其中茄科(Solanaceae)和禾本科(Poaceae)居多[2，3]。十字花科蔬菜中，蘿卜(Raphanussativus)[4]、花椰菜(B.oleraceavar.italica)[5]、大白菜(B.rapassp.pekinensis)[6]等也開展了花藥培養的研究并取得一定成果。植物的花藥培養一般都是通過培養基中加入激素誘導愈傷組織產生，再促使愈傷組織分化形成植株，培養基中激素的種類、濃度和配比，常常對誘發小孢子啟動、分裂、生長和分化具有很大的影響，是花藥愈傷組織形成的主要因素，但不同植物或同種植物不同基因型要求的激素組合和濃度有所區別[7～9]。

結球甘藍(Brassicaoleraceavar.capitata)是我國栽培面積較大的蔬菜作物之一，在蔬菜的周年供應中占有重要的地位。然而，國內對結球甘藍花藥培養影響因子的研究甚少。陳世儒等[10]通過皺葉甘藍花藥培養獲得了單倍體植株，王超楠等[11]對羽衣甘藍(B.oleraceavar.acephala)進行花藥培養并獲得了單倍體植株。這些研究雖獲得一定成功，但存在誘導率較低等問題。本研究以結球甘藍2個基因型為材料，選用KT、2,4-D、6-BA 3種激素研究不同激素配比、濃度對結球甘藍花藥愈傷組織誘導的影響，以期為建立完善的結球甘藍花藥培養體系提供依據，進而為結球甘藍花藥培養育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試結球甘藍基因型為475、476，由江蘇省農業科學院提供。2009年7月播種，高畦栽培過冬。2010年3～5月陸續開花，于初花期從生長健壯、無病蟲害的結球甘藍植株上取綠色、長2～4 mm花蕾帶回實驗室進行花藥培養。

主要藥劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)和激動素(KT)均購自上海化學試劑公司。

1.2 方法

(1)材料的處理與培養 取新鮮的花蕾，用體積分數75% 酒精浸泡60 s，再浸入質量濃度0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，用無菌水沖洗3次，然后置于墊有消毒濾紙的培養皿中，吸去多余水分，用鑷子剝開花蕾，取下花藥備用，接種到培養基中。以B5(5 g/L 瓊脂，60 g/L蔗糖，pH 5.8)為基礎培養基。

(2)激素組合的誘導培養 以B5培養基為基礎培養基，激素配比按正交試驗設計，每個處理9皿，每皿15個花藥進行培養，以篩選結球甘藍花藥培養誘導愈傷組織的最佳激素組合。

(3)培養條件 接種后先在30 ℃下暗培養2 d，然后轉入25 ℃暗培養2周左右，再轉入25 ℃，光強為3000 ～ 4 000 lx，12 h/12 h光/暗條件下培養，3周左右進行愈傷組織統計。

(4)數據處理 試驗數據利用正交設計軟件和DPS軟件進行處理。誘導率(%) =花藥胚狀體或愈傷組織塊數/接種花藥數×100。

2 結果與分析

2.1 結球甘藍花藥愈傷組織的形成和發生

將花藥接種到愈傷誘導培養基上(圖版Ⅲ圖1A)后，先在30 ℃下暗培養2 d，然后轉入25 ℃暗培養2周左右，再轉入25 ℃光培養室培養，花藥陸續膨大，花藥開始發生縱裂進入分裂期，形成結構疏松而透明的組織(圖版Ⅲ圖1B)；隨后細胞團繼續分化，形成一團沒有分化能力的愈傷組織塊(圖版Ⅲ圖1C)。結果顯示，不同預處理時間和培養基上的花藥都能誘導出愈傷組織，愈傷先從藥絲口處形成；接種到愈傷誘導培養基上30 d后，沒有形成愈傷組織的花藥逐漸發褐死亡。

2.2 激素對結球甘藍花藥愈傷組織誘導的影響

(1)不同激素對結球甘藍花藥愈傷組織誘導的影響 從圖2和表1可以看出，2,4-D濃度越高，結球甘藍花藥愈傷誘導率越高，當2,4-D的濃度達到2.0 mg/L時，475、476 2個材料愈傷誘導率達到最高，分別是28.59%和41.28%，而且2,4-D在2個基因型中誘導率極差較大，分別是19.26%、24.98%，說明2,4-D對結球甘藍花藥培養影響較大；圖1的6-BA的效應曲線表明，2個基因型475、476在未加入6-BA的培養基上愈傷誘導率最高，隨著培養基中加入6-BA濃度的增大，愈傷誘導率發生下降的現象，但是幅度很小，分別是1.86%和3.87%，說明6-BA在結球甘藍花藥培養中的影響很小；從KT的曲線效應圖看出，KT濃度為1.0 mg/L時475和476愈傷誘導率最高，分別是20.00%、32.76%，當KT濃度達到2.0 mg/L時，誘導率稍有下降，2個基因型隨KT濃度的改變誘導率振幅分別為2.96%和6.09%，說明KT對結球甘藍花藥培養有一定的影響。結果表明，參試的3種激素及試驗濃度范圍內，2,4-D的濃度對結球甘藍花藥培養影響最大，其次是KT，6-BA基本無影響。

圖2 不同激素對結球甘藍花藥愈傷組織誘導影響的效應圖Figure 2 The effects of different hormone on anther callus induction

(2)不同激素組合對結球甘藍花藥愈傷誘導培養的影響 由表1可以看出，各個激素組合的培養基都能誘導出一定數量的愈傷組織，激素組合中2.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L KT 2個基因型的花藥愈傷誘導率都最高，分別達到35.56%和55.56%，而激素組合0.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L

表1 正交設計不同激素組合處理花藥愈傷組織誘導率Table 1 The callus induction frequency of the different hormone compositions

KT，2個基因型愈傷誘導率均最低，只有4.44%。盡管不同的激素組合的花藥愈傷誘導率存在較大的差別，2個基因型的極差分別為31.12%和51.12%，但不同的激素組合處理2個基因型愈傷誘導效果基本無區別。結果表明，2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT激素組合的結球甘藍愈傷誘導效果最好。

3 討論

植物的花藥培養一般都是通過培養基中加入激素產生愈傷組織，再促使愈傷組織分化形成植株，激素的種類、濃度和配比，對誘發小孢子啟動、分裂、生長和分化影響很大。本研究選用的2,4-D、6-BA、KT中，2,4-D對結球甘藍愈傷和胚狀體形成影響最大，這與陳曉等[7]、楊博智等[8]等在辣椒上的研究結果一致，可能在花藥離體培養過程中，2,4-D對花粉的啟動、分裂、形成愈傷組織和胚狀體起著決定性的作用，但2,4-D濃度上限還有待進一步研究。

本研究的正交試驗設計結果表明，結球甘藍花藥愈傷誘導最優激素組合為2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT，當2,4-D為2.0 mg/L時，KT為2.0 mg/L，誘導率下降了10%以上；當2,4-D為2.0 mg/L時，6-BA為0 mg/L時誘導率最高，而6-BA為 0.5 mg/L和1.0 mg/L，誘導率均降低，可能6-BA濃度梯度范圍設置在0～0.5 mg/L間，結球甘藍花藥愈傷誘導較敏感，或者6-BA對KT影響結球甘藍花藥愈傷誘導有負效應，但影響很小；當3種激素同時加入培養基中，結球甘藍花藥愈傷誘導率變幅比較大，即影響大。激素間的互作效應比較復雜，因此激素對結球甘藍花藥愈傷誘導的傳導機制網絡有待深入研究。前人對茄科和禾本科作物的研究[2，3]表明，愈傷組織的誘導除受培養基激素的種類和配比影響較大外，還受植物基因型、花藥發育時期、花蕾預處理等影響，所以要建立完善的結球甘藍花藥愈傷組織誘導體系還需要進一步深入研究。本研究為結球甘藍花藥愈傷組織誘導體系的建立奠定了必要的基礎。

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2010-08-25

江蘇省農業科技自主創新項目(cx(09)127)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2008378)；國家“863”計劃項目(2006AA100108)

王神云(1980-)，女，內蒙古巴彥淖爾人，農學碩士，助理研究員，主要從事蔬菜育種研究.

李建斌，E-mail:jbli0518@163.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.017

S635.1

A

1673-1409(2010)03-S048-03