兔附紅細(xì)胞體的體外培養(yǎng)

李曉云 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

賈杏林 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

石德時(shí)，畢丁仁 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

兔附紅細(xì)胞體的體外培養(yǎng)

李曉云
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

賈杏林
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

石德時(shí)，畢丁仁
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

為探討無細(xì)胞條件下體外連續(xù)培養(yǎng)兔附紅細(xì)胞體的方法，將感染附紅細(xì)胞體的兔紅細(xì)胞接種到多種培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，不添加陰性紅細(xì)胞，每次傳代更換半量培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)配方篩選的霉形體培養(yǎng)基培養(yǎng)兔附紅細(xì)胞體效果最佳，兔附紅細(xì)胞體存活可達(dá)300 d，并保持感染兔陰性紅細(xì)胞的能力。兔附紅細(xì)胞體可以在經(jīng)配方篩選的霉形體培養(yǎng)基中長期存活并緩慢增殖。

嗜血性霉形體(附紅細(xì)胞體)；兔；PPLO肉湯；體外培養(yǎng)

近年來的研究表明，寄生在哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞表面的、缺少細(xì)胞壁的多形態(tài)微生物，分類學(xué)上應(yīng)屬于霉形體(Mycoplasma,M)，為區(qū)別于原有的霉形體，又稱為嗜血性霉形體(Haemomycoplasma,HM)[1～4]。由于附紅細(xì)胞體的體外培養(yǎng)技術(shù)缺乏，致使其研究主要局限于分類學(xué)、分子診斷等方面。Nonaka[5]、張守發(fā)[6]、房春林[7]等通過添加陰性紅細(xì)胞的方法嘗試了豬、牛、兔等動(dòng)物的附紅細(xì)胞體的體外培養(yǎng)，近年李曉云等[8,9]先后進(jìn)行了豬附紅細(xì)胞體(M.suis)和犬附紅細(xì)胞體的體外無細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，但體外無細(xì)胞培養(yǎng)兔附紅細(xì)胞體的試驗(yàn)，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與主要試劑

主要試劑有PPLO Broth(Difco)、滅活新生牛血清(BS，杭州四季青生物技術(shù)有限公司)、馬血清(equine serum,ES,Hyclone)、豬血清(porcine serum,PS,Gibco )、M199、DMEM、RPMI1640、DMEM/F12(Gibco)、NAD(Amresco)、強(qiáng)力霉素(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)等，其它試劑均為AR級。

培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[8～10]的方法配制，PPLO基礎(chǔ)液、添加成份(Supplement，S)、3種PPLO完全培養(yǎng)液(PPLO-S-BS,PPLO-S-ES，PPLO-S-PS)，M199-BS、DMEM-BS、RPMI1640-BS、DMEM/F12-BS按說明書配制后添加20%(v/v)BS。所有培養(yǎng)液4 ℃保存?zhèn)溆茫褂们坝? mol/L NaOH 或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.2 病原及紅細(xì)胞

靜脈采集消瘦、貧血的新西蘭大白兔全血，檸檬酸三鈉抗凝，對采集的紅細(xì)胞進(jìn)行懸液鏡檢、Giemsa染色鏡檢，觀察其形態(tài)染色特點(diǎn)，篩選感染附紅細(xì)胞體的血樣。兔附紅細(xì)胞體陰性紅細(xì)胞，同法采集自健康無附紅細(xì)胞體病史兔，經(jīng)染色鏡檢未觀察到染蟲現(xiàn)象。上述血樣部分4 ℃短期保存，其余液氮罐中長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原接種與培養(yǎng)

感染附紅細(xì)胞體的兔紅細(xì)胞，參考文獻(xiàn)[8,9]的方法分別接種到PPLO-S-BS、PPLO-S-PS、PPLO-S-ES、PPLO-S、M199-BS、DMEM-BS、RPMI1640-BS、DMEM/F12-BS中培養(yǎng)，不添加陰性紅細(xì)胞，每次傳代更換半量培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下(400×)觀察蟲體的生長存活狀態(tài)及紅細(xì)胞形態(tài)變化、溶血情況。選擇蟲體生長狀況最好的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

1.4 培養(yǎng)物的鑒定

培養(yǎng)期間定期收集培養(yǎng)物，采用文獻(xiàn)[8,9]的方法鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔附紅細(xì)胞體分離鑒定

直接鏡檢可見染蟲紅細(xì)胞有不同程度的變形，染蟲數(shù)量不同的紅細(xì)胞形態(tài)不同，有“棘球”狀、環(huán)形“串珠”狀、近圓形等(圖版Ⅳ圖1)，蟲體呈飽滿光亮的球狀顆粒，紅細(xì)胞具有自主運(yùn)動(dòng)，包括上下前后左右擺動(dòng)、短距離滑行、滾轉(zhuǎn)。Giemsa染色結(jié)果顯示，蟲體著淺藍(lán)色，呈中央清亮的環(huán)狀(圖版Ⅳ圖2)，與布坎南描述的附紅細(xì)胞體染色特點(diǎn)一致[11]。

2.2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)效果的比較及培養(yǎng)基篩選

染蟲兔紅細(xì)胞接種后，紅細(xì)胞于12～72 h間溶血，成為帶蟲血影，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果的比較見表1。由表1可知，PPLO-S-BS培養(yǎng)基中蟲體顆粒飽滿，單個(gè)血影上蟲體數(shù)量較多，血影形態(tài)較完整，故選擇PPLO-S-BS作為兔附紅細(xì)胞體連續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液。

表1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)兔附紅細(xì)胞體結(jié)果Table 1 The results of in vitro cultivation of Haemomycoplasma of Rabbit in various culture media

2.3 連續(xù)培養(yǎng)

帶兔附紅細(xì)胞體血影可連續(xù)培養(yǎng)300 d以上，其形態(tài)特點(diǎn)基本不變，保持自主運(yùn)動(dòng)性。培養(yǎng)過程中，未添加任何紅細(xì)胞，血影染蟲率維持近100%，游離蟲體較少。

2.4 培養(yǎng)物鑒定

(1)光鏡特點(diǎn) 血影直接壓片鏡檢結(jié)果見圖版Ⅳ圖3。鏡下可見透明的血影附著5～6個(gè)以上大小不等的顆粒狀蟲體，主要分布在血影周緣，血影有擺動(dòng)、短距離滑行、滾轉(zhuǎn)等形式的自主運(yùn)動(dòng)。Giemsa染色后血影上蟲體深藍(lán)色。

(2)培養(yǎng)物感染陰性紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果 PPLO-S-BS中帶蟲血影與陰性紅細(xì)胞共同培養(yǎng)6 h后，少量紅細(xì)胞上開始觀察到染蟲現(xiàn)象，致12 h后染蟲率達(dá)到25%左右。

(3)培養(yǎng)物對抗生素的敏感性 強(qiáng)力霉素作用后，鏡下觀察到大量的細(xì)小的形態(tài)不規(guī)則的蟲體出現(xiàn)在培養(yǎng)液中，作升降、扭轉(zhuǎn)、翻滾、伸屈、搖擺、轉(zhuǎn)圈等運(yùn)動(dòng)。作用30 min后血影以及游離出來的蟲體均靜止不動(dòng)，血影上蟲體數(shù)量明顯減少。相同濃度青霉素、鏈霉素作用后，未觀察到血影形態(tài)及運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)的變化。

結(jié)果表明兔附紅細(xì)胞體感染血影所帶寄生體具有感染陰性紅細(xì)胞的能力，保持自主運(yùn)動(dòng)活性，對強(qiáng)力霉素敏感，對青霉素、鏈霉素不敏感。

上述研究結(jié)果表明,兔附紅細(xì)胞體可以在經(jīng)配方篩選的霉形體培養(yǎng)基中長期存活并緩慢增殖。

3 討論

本研究篩選的霉形體培養(yǎng)基能夠在無細(xì)胞條件下體外長期維持兔附紅細(xì)胞體的存活，對于解決兔附紅細(xì)胞體體外培養(yǎng)技術(shù)具有重要意義。上述結(jié)果與培養(yǎng)M.suis[8]、犬附紅細(xì)胞體[9]的結(jié)果相近，進(jìn)一步從培養(yǎng)特性的角度一定程度上支持了附紅細(xì)胞體屬于霉形體的觀點(diǎn)。

本研究除首次接種的染蟲紅細(xì)胞外，未添加任何紅細(xì)胞或紅細(xì)胞制品，蟲體在培養(yǎng)過程中始終與血影處于黏附狀態(tài)，這一特點(diǎn)與M.suis[8]、犬附紅細(xì)胞體[9]相同，可見兔附紅細(xì)胞體的存活也并不依賴活的紅細(xì)胞。

比較不同排培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果，霉形體培養(yǎng)基優(yōu)于人工配方培養(yǎng)基，血清是必須添加的成份之一，BS優(yōu)于PS和ES。而在人工培養(yǎng)基中，DMEM/F12中存活情況最差，DMEM/F12與M199、DMEM、RPMI1640的配方差異主要在微量元素(Cu2+、Fe3+、Zn2+)[12]。上述結(jié)果顯示，血清中某些成份、存在于霉形體培養(yǎng)基中而人工培養(yǎng)基中缺乏的某些天然成份，包括某些微量元素可能與附紅體存活有密切關(guān)系，對上述問題的進(jìn)一步研究將有助于解決目前附紅細(xì)胞體在體外培養(yǎng)條件下尚不能大量增殖的難題。

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2010-07-08

湖南省科技廳資助項(xiàng)目(2009FJ3021)；湖南省教育廳資助項(xiàng)目(10C0809)

李曉云(1968-)，女，湖北天門人，農(nóng)學(xué)博士，講師，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫方向研究.

畢丁仁，E-mail: bidingren@mail.hzau.edu.cn.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.018

S852.62;Q813.1

A

1673-1409(2010)03-S051-03