PCR和染色鏡檢方法診斷豬附紅細胞體的比較

賈杏林 (湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128;中國農業大學動物醫學院，北京 100094)

齊長明 (中國農業大學動物醫學院，北京 100094)

沈志強， 田鳳榮，莊金秋 (山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256618)

PCR和染色鏡檢方法診斷豬附紅細胞體的比較

賈杏林
(湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128;中國農業大學動物醫學院，北京 100094)

齊長明
(中國農業大學動物醫學院，北京 100094)

沈志強， 田鳳榮，莊金秋
(山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256618)

參照Hoelzle等報道的豬附紅細胞體(Mycoplasmasuis)PCR診斷方法，提取病原DNA進行PCR擴增，經克隆、測序得到781 bp片段，與Genbank中序列(登錄號AJ504999)進行比較，同源性為99.4%。用該方法從大腸桿菌等豬常見病原基因組未擴增出相同的序列，表明其特異性好。以PCR和染色鏡檢方法分別檢測3個豬場15份臨床發病豬血液樣品，M.suis陽性率均為100%，結果符合率為100%，差異不顯著(Pgt;0.05)；PCR檢測和涂片染色鏡檢5個豬場25份臨床健康豬血樣，M.suis陽性率分別為100%和68.0%，二者符合率為68.0%，差異顯著(Plt;0.05)。

豬附紅細胞體(Mycoplasmasuis)；PCR；染色鏡檢

豬附紅細胞體(Mycoplasmasuis)病是一種以貧血、黃疸和發熱為主要特征的人畜共患病,我國多個省市都有該病發生，給養豬業帶來了較大的經濟損失[1]。在該病的病原學診斷方法中，確診豬群慢性感染標準是脾切除和顯微鏡觀察來證實豬的寄生蟲血癥，通過臨床癥狀來證實急性發病[2],但此法不適合群體診斷。血液涂片染色鏡檢方法是目前診斷該病原最常用的方法，該方法快速簡便，但有學者認為豬紅細胞形態變化可以由許多因素導致[3],因此形態學診斷結果的可靠性需要進一步研究。Hoelzle等報道了PCR診斷方法,該方法準確可靠、靈敏度高，適合大量樣品的檢測[4]。本研究對M.suis涂片染色鏡檢方法和PCR方法進行了比較，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗豬血 15份患病豬血采自山東省表現出豬附紅細胞體病臨床癥狀的3個豬場，病豬皮膚發紅，體溫40.0～41.5 ℃,采食減少、飲水增加；25份臨床健康豬血采自山東省5個豬場，豬臨床指標正常。所有血液樣品用肝素鈉抗凝，血液涂片后姬姆薩染色見紅細胞周圍有微生物附著，呈小突起狀，SPF豬血由中國農業大學司興奎博士饋贈。

(2)對照細菌和病毒 鏈球菌購自中國獸藥監察所，巴氏桿菌、大腸桿菌O78、沙門氏菌由山東濱州獸醫生物技術重點開放實驗室分離鑒定；羊邊蟲、巴貝斯焦蟲基因組由中國農科院蘭州獸醫研究所饋贈；豬弓形體抗原購自中國農科院蘭州獸醫研究所；PRRSV由中國農業大學實驗動物所饋贈；PRV為疫苗毒株。

(3)酶及主要試劑 pUC18-T、蛋白酶K、IPTG、X-gal、DNA膠回收試劑盒、反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶購自上海生物工程公司。CTAB購自鼎國生物技術中心。

(4)引物的設計與合成 引物參照Hoelzle 等[4]的方法由上海生工合成，上游引物(P1)為5’-GCATTGCCCAGTCCCCAAGGA-3’，下游引物(P2)為5’-TGCGGGGAGTACGTGGGAAGG-3’。

1.2 試驗方法

(1)病原DNA的提取M.suis基因組的提取參照Hoelzle等[4]的方法略作改動。取500 μL豬血加入1.5 mLEP管中，13 000 r/min離心20 min，棄去上清；沉淀中加入400 μLTE(pH 8.0)溶解，然后加入15 μL溶菌酶混勻后37 ℃水浴1 h，再加入10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和70μL10%SDS溶液56 ℃水浴30min；加入 100 μL5 mol/L NaCl溶液和160 μL5%CTAB溶液，65 ℃水浴10 min；加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提2次，等體積冷異丙醇沉淀30 min，12 000 r/min離心10 min；70%乙醇溶液漂洗1次，干燥，TE(pH8.0)溶解，-20 ℃保存。弓形體、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌和巴氏桿菌培養離心后，基因組的提取同上述方法。PRV和PRRSV基因組提取按文獻[5,6]的方法進行。

(2)PCR擴增 50 μL體系中加入5 μL 10×Buffer溶液，31.5 μLddH2O，4 μL25 mmol/L MgCl2溶液，3 μLdNTP，上、下游引物各2 μL，2 μLM.suis基因組，0.5 μLtaq DNA聚合酶，混勻，放入PCR儀中擴增。反應條件為：94 ℃預熱10 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共36個循環，最后72 ℃延伸7 min。對照病毒、細菌用同樣的條件進行PCR擴增。

(3)PCR產物的克隆與測序 將PCR產物加樣于1%瓊脂糖凝膠上電泳，2 000 bp Marker作對照，用回收試劑盒回收約大于780 bp的片段，回收產物連接到PUC18-T載體上，轉化到DH5α感受態細胞，陽性菌液送上海生工測序。將所測得核苷酸序列片段與Hoelzle等[4]報道的診斷序列進行同源性比較。

(4)PCR與涂片染色方法比對試驗 用PCR與涂片染色鏡檢方法同步檢測8個豬場40份送檢豬血，分別統計陽性陰性結果，并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 涂片染色結果

檢測40份血液樣品M.suis均為陽性，紅細胞表面有點狀突起，形狀不規則，有染成紫色的M.suis附著(圖版Ⅱ圖1)。

2.2 M.suis診斷序列的擴增

經PCR擴增得到大約780 bp的DNA片段，與預期片段大小一致。陰性對照未擴增出片段(圖版Ⅱ圖2)。

2.3 測序分析及同源性比較

目的片段與PUC18-T載體連接并轉化到DH5α感受態細胞后，陽性細菌送往上海生工測序，大小為781 bp，與Genbank上的M.suis相關序列(登錄號AJ504999)比較，同源性為99.4%，該診斷序列DNA在53 bp處A變成了G；在161 bp、246 bp、247 bp處各缺少一個C；780 bp和781 bp之間多出一個C，表明該PCR方法擴增的是M.suis特異性的條帶。

2.4 M.suis診斷序列擴增的特異性

用該引物和反應條件未從SPF豬血和豬弓形體、羊鞭蟲、鏈球菌、巴貝氏焦蟲、大腸桿菌、PRRSV、PRV、沙門氏桿菌、巴氏桿菌中未擴增出該片段(圖版Ⅱ圖3)，表明該方法有較好的特異性。

2.5 比對試驗

用涂片染色鏡檢方法與PCR同步檢測8個豬場送檢40份豬血，2種方法檢測結果總符合率為80.0%(32/40)，差異顯著(Plt;0.05)；其中3個發病豬場15份血液樣品，M.suis陽性率均為100%，二者符合率為100%，差異不顯著(Pgt;0.05)；檢測5個臨床健康豬場25份血液樣品，涂片染色方法M.suis陽性率為100%，PCR檢測M.suis陽性率為68.0%，二者符合率為68.0%，差異顯著(Plt;0.05)。

3 討論

血液涂片染色鏡檢是檢測M.suis的最快速簡便直觀的方法，但其不足之處是容易出現假陽性。Hoelzle等建立了診斷M.suis的PCR方法，通過斑點雜交證實了該方法的特異性[4]。本研究對該方法進行了改進，擴增到同源性高達99.4%的片段，用該方法未從其他常見豬病病原中擴增到DNA片段，表明該方法有較好的特異性。

國外文獻少見豬附紅細胞體病暴發和豬嚴重死亡的報道，且多以貧血、黃疸等慢性疾病為主，而國內多以大面積暴發、高熱紅皮、死亡率高為主，出現這種情況可能是由于病原變異所致，但目前關于該病的分子流行病學研究報道較少，因而急需進行該方面的研究，為更好的防制該病提供基礎。

本研究采用2種方法分別檢測同一血樣，對臨床發病豬二者符合率高達100%，但對M.suis病原攜帶臨床健康豬符合率大大降低。究其原因，一方面是由于染色鏡檢可能存在假陽性等局限，另一方面與發病豬本身攜帶病原，其單位體積血樣病原數可能更多有關。因此，在對豬附紅細胞體病的疑似病例進行確診時結合PCR診斷是很必要的。

[1]Wu J,Yu J,Song C,etal.Porcine eperythrozoonosis in China[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1081:280～285.

[2]Heinritzi K.A contribution on splenectomy in swine[J].Tierarztl Prax,1984,12:451～454.

[3]張家崢，劉小燕，李召展，等．對豬發生“附紅細胞體病”的調查研究和討論[J].河南畜牧獸醫,2003,24(1):26～29.

[4]Hoelzle LE,Adelt D,Hoelzle K,etal.Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection ofMycoplasmasuis(Eperythrozoon suis) in porcine blood[J].Vet Microbiol.,2003,93:185～196.

[5]李學伍，陳煥春，楊艷艷，等．PCR法對偽狂犬病病豬不同部位的檢測及敏感性試驗[J]．中國畜禽傳染病，1998,20(6):365～368.

[6]仇華吉，郭寶清，童光志，等．豬繁殖-呼吸道綜合征病毒(PRRSV)CH-La株基因型鑒定[J].中國獸醫學報，1998,18(2):118～120.

2010-08-05

湖南省科技廳資助項目(2009FJ3021)；湖南省教育廳資助項目(10C0809)

賈杏林(1970-)，男，湖北天門人，農學博士，副教授，主要從事動物輸血與血液病研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.012

S852.62

A

1673-1409(2010)03-S032-03