淺析遺傳多樣性的研究方法

陳珊珊，周明芹 (長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

淺析遺傳多樣性的研究方法

陳珊珊，周明芹
(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

綜述了檢測遺傳多樣性的形態學標記、細胞學標記、生物化學標記和分子標記4種遺傳標記的發生與發展過程，并比較了各自的優缺點及其應用。

遺傳多樣性、形態學標記、細胞學標記、生物化學標記、DNA分子標記

遺傳多樣性(genetic diversity)是生物多樣性的重要組成部分，是生態系統多樣性和物種多樣性的基礎，任何物種都有其獨特的基因庫或遺傳組織形式[1]。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和，但通常所說的遺傳多樣性是指種內的遺傳多樣性，即種內不同種群之間或一個種群內不同個體的遺傳變異[2]。遺傳多樣性的表現形式是多層次的，可以從形態特征、細胞學特征、生理特征、基因位點及DNA序列等不同方面來體現，其中DNA多樣性是遺傳多樣性的本質[3]。通常，遺傳多樣性最直接的表現形式就是遺傳變異水平的高低。然而，對任何一個物種來說，個體的生命是短暫的、有限的，而由個體構成的種群或種群系統(宗、亞種、種)在自然界中具有其特定的分布格局，在時間上連續不斷，是進化的基本單位。因此，遺傳多樣性不僅包括變異水平的高低，而且包括變異的分布格局，即種群的遺傳結構。種群遺傳結構上的差異是遺傳多樣性的重要體現，一個物種的進化潛力和抵御不良環境的能力既取決于種內遺傳變異的大小，也有賴于種群的遺傳結構[4]。

遺傳多樣性的研究具有重要的理論和實際意義。物種或居群的遺傳多樣性程度是長期進化的產物，是其生存(適應)和發展(進化)的前提。一個居群(或物種)遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，對環境變化的適應能力就越強，越容易擴展其分布范圍和開拓新的環境，因此，對遺傳多樣性的研究可以揭示物種或居群的進化歷史(起源的時間、方式等)，也能為進一步分析其進化潛力和未來命運提供重要資料，尤其有助于物種稀有或瀕危原因及過程的探討。遺傳多樣性的研究不僅與資源的收集、保存和更新密切相關，而且是種質資源創新和品種改良的基礎。準確評價在DNA分子水平上的遺傳多樣性，不僅可以為親本選配、后代遺傳變異程度及雜種優勢的預測提供預見性指導，而且還有助于了解品種間的系譜關系，進行品種鑒定和品種分類以及分析物種的起源與進化[1～4]。

對遺傳多樣性的系統研究始于十九世紀，達爾文在《物種起源》中用大量資料和證據揭示出生物中普遍存在變異現象，并發現了大部分變異有遺傳現象，他把這種可遺傳的變異稱為多樣性。隨著孟德爾遺傳定律的重新發現，摩爾根染色體遺傳學及后來發展的細胞遺傳學的誕生為群體遺傳理論的發現奠定了基礎并提供了科學的實驗證據，充分證實了在自然界中確實存在大量的遺傳變異。

隨著生物學理論和技術的不斷進步，以及實驗條件和方法的不斷改進，檢測遺傳多樣性的方法日益成熟和多樣化，可從不同的角度和層次來揭示物種的變異。遺傳標記(genetic markers)的發展經歷了形態學標記(morphological markers)、細胞學標記(cytological markers)、生物化學標記(biochemical markers)和分子標記(molecular markers)4個主要階段。

1 形態學標記

形態學標記是與目標性狀緊密連鎖、表型上可識別的等位基因突變體，即植物的外部特征特性。典型的形態學標記用肉眼即可識別和觀察；廣義的形態學標記還包括借助簡單測試即可識別的性狀，如生理特性、生殖特性、抗病蟲性等[5]。從形態學或表型性狀上來檢測遺傳變異是最古老也是最簡便易行的方法。通常所利用的表型性狀有2類，一類是符合孟德爾遺傳規律的單基因性狀，如質量性狀、稀有突變等，另一類是由多基因決定的數量性狀[6]。由于自然界中單基因性狀較少，作為遺傳標記，主要是用于一些農作物、林木、園藝作物及其野生近緣種的遺傳多樣性研究，而且多用于研究交配系統、基因流和選擇等進化因素。而數量性狀的變異則大量存在，對其進行研究同樣能分析居群或個體的遺傳變異，并且結合數量遺傳學的方法來研究數量性狀的遺傳變異，通過特定的雜交試驗和后代測定能分析性狀在親本與子代間的傳遞規律，并將影響變異的遺傳因素同環境因素區分開，從而確定遺傳因素在性狀變異中的相對重要性；同時能分析遺傳和環境的交互作用，甚至可以估算控制數量性狀的多基因的位點數目[2，3]。

形態學標記已被廣泛應用于遺傳圖譜的構建[7]、品種演化與分布歷史推測[8]、種質資源遺傳多樣性的分析[9，10]、種質資源的分類與鑒定[11，12]、雜交親本的選配和核心種質的構建[13]等研究中。

雖然用形態學標記研究遺傳多樣性具有簡便、易行、快速等特點，但是，由于表型性狀是基因型與環境共同作用的結果，往往因環境因素的影響而發生變化，有時表型性狀的變異并不能真實反映遺傳變異；同時，形態標記數量有限，觀測標準容易受到觀測者的主觀判斷影響。因此，要更加準確、全面地了解物種的遺傳多樣性，僅僅依賴形態標記是遠遠不夠的，還必須結合其他的標記技術，進行更深層次的研究[14]。

2 細胞學標記

細胞學標記主要是染色體的核型和帶型分析。染色體是遺傳物質的載體，是基因的攜帶者。與形態學變異不同，染色體的變異必然會導致遺傳變異的發生，是生物遺傳變異的重要來源。研究表明，在任何生物的天然居群中，都存在或大或小的染色體變異。染色體的變異主要表現為染色體組型特征的變異，包括染色體數目的變異(整倍性或非整倍性)和染色體結構的變異(缺失、易位、倒位、重復等)，染色體的形態(著絲點位置)、縊痕和隨體等核型特征也是多樣性的來源。染色體分帶(chromosome banding) 指借助于一套特殊的處理程序，使染色體顯現出深淺不同的帶紋，常見染色體帶型有C 帶、G 帶、R 帶、Q 帶等[15]。在植物中，染色體的多倍性現象廣泛存在，Lewin研究發現約7%的雙子葉植物有多倍現象，共涉及114科660屬2 800種[16]。

植物染色體的數目、形態等是最穩定的細胞學特征之一，染色體的核型、帶型等是表明該種系統演化位置以及和近緣種親緣關系的重要依據，是探討植物親緣關系和進化趨勢的一個重要途徑[17]。Tuna等[18]研究了無芒雀草(Bromusinermis)染色體的核型和帶型，推測四倍體無芒雀草可能是異源四倍體，八倍體無芒雀草不是由四倍體的染色體直接加倍形成的。Liu等[19]對山龍眼科Leucadendron屬27個物種的核型進行研究，發現它們的染色體都具有對稱性，從細胞學的角度證明了該屬的原始性。汪衛星等[20]比較番木瓜(Caricapapaya)的四倍體與二倍體植株的核型特征，發現二者沒有明顯的區別，由此認為其四倍體是由二倍體直接加倍形成的同源四倍體。

細胞學標記直觀、穩定，克服了形態標記易受環境條件影響的缺點。隨著染色體技術的發展，如細胞原位雜交技術的應用，在染色體水平上將揭示出更加豐富的遺傳多樣性。但是有些物種忍受染色體結構和數目變異的能力較差而難以獲得相應的標記材料，某些物種雖有標記材料，但常常伴隨著標記對生物有害的表型效應，使觀測和鑒定比較困難，而且大多數染色體的細胞學標記數目有限，導致該技術在較低分類階元的應用受到限制[21，22]。

3 生物化學標記

生物化學標記是指利用植物代謝過程中具有特殊意義的生化成分或產物進行品種鑒定和遺傳多樣性研究的技術。許多生物大分子或生物化合物都具有作為遺傳標記的潛力。一些次生代謝物如香精油、類黃酮、糖苷類、類萜等都可以作為遺傳標記來評價遺傳多樣性[23]，但由于分離和檢測這些分子的技術和手段比較復雜，很難適應大群體的常規檢測，因而在實際研究中，用次生代謝物作為遺傳標記的很少[24]。與此相反，許多蛋白質(包括非酶蛋白和酶蛋白)分子數量豐富、分析簡單快速，能更好地反映遺傳多樣性，是比較理想的遺傳標記。在非酶蛋白中，用的比較多的是種子貯藏蛋白[25～28]；在酶蛋白中，用的比較多的是同工酶(isoenzyme)[29，30]。同工酶是指具有相同催化功能而結構及理化性質不同的一類酶，其結構的差異來自基因類型的差異，其電泳酶譜的多態性可能是由不同的基因引起的，也可能是由同一基因座位上的不同等位基因引起的，后者特稱為等位酶(allozymes)。

同工酶標記(isoenzyme marker)是20世紀60年代興起的一門標記技術，廣泛應用于種群遺傳結構與交配系統的研究，種群內與種群間等位基因頻率的估測以及品種鑒定[31～34]等方面。

同工酶在生物界普遍存在，并以共顯性方式表達，幾乎不受環境因素的影響，表現出相對穩定性。但是同工酶是基因表達的產物，具有組織特異性，易受發育階段的影響[22]；只能檢測編碼蛋白的基因位點，不能檢測非結構基因位點；加上能夠利用的具有多態性的同工酶種類有限，并且每種酶檢測的位點數目較少，多態性不高，因此在多數情況下，同工酶標記沒有DNA標記敏感，其多態性也沒有DNA標記高[35，36]。

4 DNA分子標記

形態學標記、細胞學標記和同工酶標記都是基因表達的結果，是對基因的間接反映，標記數目有限、多態性較差。DNA分子標記是以個體間核苷酸序列差異為基礎的遺傳標記，是DNA水平上遺傳變異的直接反映，能更準確地揭示種、變種、品種、品系乃至無性系間的差異。與前3種標記相比，DNA標記具有以下優越性：(1)較高的可靠性，直接以DNA的形式表現，不受環境因素、取樣部位和發育階段的影響，不存在基因表達與否的問題；(2)數量多，遍及整個基因組；(3)多態性高，自然存在著許多變異；(4)表現為“中性”，不影響目的基因的表達，與不良性狀無必然的連鎖；(5)有許多分子標記表現為共顯性，能夠鑒別純合基因型與雜合基因型[37，38]。由于分子標記的巨大優越性，近年來在生物科學領域中的應用相當廣泛。根據所依賴的技術手段的不同，DNA分子標記可分為3大類：第一類是以雜交技術為基礎的分子標記，如限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)標記、數目可變串聯重復多態性(variable number of tandem repeats，簡稱VNTR)標記；第二類是基于PCR技術為基礎的分子標記，如隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphism DNA，簡稱RAPD)標記、任意PCR(arbitrary primed PCR，簡稱AP-PCR)標記、DNA指紋(DNA amplified fingerprints，簡稱DAF)標記、序列特征化擴增區域(sequence-characterized amplified regions，簡稱SCAR)標記、擴增片段長度多態性 (amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP) 標記、簡單重復序列 (simple sequence repeats，簡稱SSR)標記、內部簡單重復序列(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)標記等；第三類是基于測序和DNA芯片技術為基礎的分子標記，如表達序列標簽(expressed sequence tags，簡稱EST)標記和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)標記等[39]。隨著分子生物學研究的重心逐漸從結構基因組學向功能基因組學轉變，高等植物的分子標記也開始由過去基于基因組DNA 隨機開發的、位置不確定的DNA標記向代表轉錄譜和其他編碼序列的分子標記以及具有相應功能的功能標記發展。Andersen 和 Lübberstedt根據分子標記的發展過程定義了相應的3種類型的分子標記，即隨機DNA標記(random DNA marker，簡稱RDM)、基因靶向標記(gene targeted marker，簡稱GTM)和功能標記(functional marker，簡稱FM)。隨機DNA標記指的是來自于基因組中隨機的多態性位點的標記；基因靶向標記是來自于基因轉錄區多態性位點的標記；功能標記也是來自于基因轉錄區的多態性位點，但它的多態性能造成所在基因編碼的表型性狀的變異[40]。

自20世紀90年代以來，DNA分子標記一直是生命科學領域活躍發展的一種生物技術，不僅應用廣泛，而且新的分子標記種類不斷涌現。各種類型的標記層次特點不同，都有各自的優勢和局限性。理想的DNA分子標記應具備以下特點：(1)遺傳多樣性高；(2)共顯性遺傳；(3)在基因組中大量存在且分布均勻；(4)表現為“中性”，對目標性狀表達無不良影響，與不良性狀無必然連鎖；(5)穩定性、重現性高；(6)信息量大，分析效率高；(7)檢測手段簡單快捷，易于實現自動化；(8)開發成本和使用成本低[41]。但是迄今為止，沒有一種標記能完全滿足上述特性。因此，在具體的研究中，應該根據所分析材料的遺傳背景、研究狀況、實驗目的以及實驗條件來選用最合適的標記技術，或同時采用幾種方法進行，以便多層次、多角度、更全面、更準確地揭示物種或種群的遺傳多樣性水平。隨著分子生物學的發展和生物技術的不斷完善，相信越來越多的分子標記技術將被開發，為人類揭開生物之謎提供更有效的工具。

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2010-07-01

陳珊珊(1988-)，女，湖北天門人，研究方向為園林植物應用.

周明芹，E-mail: zhoumingqin@126.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.019

Q3-3

A

1673-1409(2010)03-S054-04