左旋多巴甲酯對(duì)斜視性弱視貓模型的作用

李勇文，林 興，張士軍，黎 榮，蔣偉哲，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

弱視是影響兒童視力的主要疾病之一，不及時(shí)治療可以導(dǎo)致終身視力低下，其形成與出生后早期的視環(huán)境不良或影響視覺(jué)發(fā)育的多種因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制尚在探索中。90年代起，國(guó)內(nèi)外學(xué)者［1］對(duì)藥物治療弱視進(jìn)行了許多臨床性的研究，目前臨床上多采用左旋多巴治療，取得了一定效果。然而，左旋多巴存在副作用多、耐受性差、效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)對(duì)左旋多巴進(jìn)行結(jié)構(gòu)得到左旋多巴甲酯(LDME)，克服了左旋多巴的缺點(diǎn)，具有易溶于水、吸收快、易進(jìn)入血腦屏障的特點(diǎn)。為觀察LDME在相對(duì)單因素條件下對(duì)弱視眼的作用，我們以斜視性弱視貓模型作實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討LDME對(duì)弱視發(fā)病機(jī)制的影響及對(duì)弱視的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 眼電生理視覺(jué)誘發(fā)電位儀:德國(guó)羅蘭RETI-Roland;包埋機(jī):日本SAKURA FINETECHNICAL CO LTD，4590型;病理組織切片機(jī):德國(guó)Leitz，2235型;病理圖像分析儀:德國(guó)萊卡公司，DMR+550型;

1.2 主要試劑 c-fos原位雜交檢測(cè)試劑盒(泰普生物科學(xué)有限公司，批號(hào):09090630);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司，批號(hào):DAB-0031);麻醉劑:烏拉坦20 g，加蒸餾水至100 ml;灌注液:NS;4℃ 40 g·L－1多聚甲醛;緩沖液:30 g·L－1檸檬酸，2 ×SSC，0.5 mol·L－1PBS;5 g·L－1多聚賴氨酸;DEPC:二乙基焦碳酸酯。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及分組 初生家養(yǎng)幼貓(4～6 wk)30只，體重約300～350 g。♀♂不分，常規(guī)檢查雙眼，確認(rèn)外眼、屈光間質(zhì)以及眼底無(wú)異常。隨機(jī)分為6組，每組5只，即正常組(NC)、模型組(MC)、陽(yáng)性對(duì)照組(PC)、鹽酸左旋多巴甲酯低劑量組(LDMEL)、中劑量組(LDMEM)、高劑量組(LDMEH)。除正常對(duì)照組外，其余于4 wk時(shí)行眼外直肌切除術(shù)以造成人工斜視，飼養(yǎng)1 mon，經(jīng)P-VEP確定形成弱視后，灌胃給與鹽酸左旋多巴甲酯20、40、80 mg·kg－1，陽(yáng)性對(duì)照組給左旋多巴 80 mg·kg－1，NC及MC均給與等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)30 d。動(dòng)物飼養(yǎng)于符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求的飼養(yǎng)環(huán)境中。

1.4 取材及腦片制作 取材前先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于給藥后d 31，測(cè)定P-VEP實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組貓均放入暗室內(nèi)飼養(yǎng)48 h，然后暴露于正常視覺(jué)環(huán)境下2 h。用20%烏拉坦麻醉，將插管經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈并切開右心房形成出口，首先經(jīng)插管快速灌注4℃生理鹽水400 ml，再灌注4%用DEPC處理過(guò)的多聚甲醛400 ml。開顱取腦，根據(jù)Snider貓立體定向圖譜，分離出對(duì)應(yīng)的視皮層17區(qū)，垂直矢狀軸切取初級(jí)視皮層的腦組織，浸入多聚甲醛液中后固定6 h，經(jīng)常規(guī)逐級(jí)脫水，二甲苯透明后，浸蠟包埋。切片厚6 μm。分別做Nissl染色和原位雜交組織化學(xué)染色。

1.5 腦片原位雜交組織化學(xué)染色程序 參照“c-fos原位雜交試劑盒使用說(shuō)明”進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選出不重疊的3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)算機(jī)顯微圖像分析，計(jì)算每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，換算成陽(yáng)性細(xì)胞的密度。各組間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較及各組貓P-VEP結(jié)果比較采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 P-VEP檢查結(jié)果各組貓P-VEP情況 從Tab 1可知，N75、P100、左右眼振幅比值、N75-135各組間均有不同程度的差異。在P100組中，MC組潛時(shí)延長(zhǎng)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;治療后各組與模型組比較，潛時(shí)均有不同程度縮短，以高劑量組最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)于左右眼振幅比值，正常組的比值是0.85，斜視組為0.49，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);經(jīng)用藥物治療后左右眼振幅比值均有所恢復(fù)，弱視眼振幅升高，以高劑量組最為明顯，與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 P-VEP of Each group(n=5)

2.2 Nissl染色光鏡觀察結(jié)果 Nissl染色中，視皮質(zhì)神經(jīng)元的尼氏小體呈深藍(lán)色，細(xì)胞核淡藍(lán)色。在40倍光鏡下，正常對(duì)照組結(jié)構(gòu)容易辨認(rèn)，能夠清楚的區(qū)分出視皮質(zhì)4層結(jié)構(gòu):自外向內(nèi)依次為分子層(Ⅰ)、外層(Ⅱ/Ⅲ)、顆粒層(Ⅳ)及內(nèi)層(Ⅴ/Ⅵ )，神經(jīng)元分布均勻，染色均一。以此作為原位雜交分層計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)。

2.3 左旋多巴甲酯對(duì)斜視性弱視貓視皮質(zhì)c-fos基因表達(dá)影響 正常對(duì)照組貓視皮層c-fos mRNA陽(yáng)性細(xì)胞分布廣泛，表達(dá)活躍，雜交細(xì)胞在各層間的分布情況為:Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ層密度較高，Ⅳ層密度最低。與正常對(duì)照組相比較，模型對(duì)照組弱視貓視皮層cfos mRNA雜交細(xì)胞在各層均減少，差異有顯著性(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，治療組(包括PC、LDMEL、LDMEM、LDMEH)c-fos mRNA 雜交細(xì)胞在視皮質(zhì)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ層均有增加，除在Ⅳ外，其余各組差異有顯著性(P<0.05)，而其中以LDMEH組最為明顯(P<0.01)，見Tab 2。

Tab 2 Density of expression of positive staining neurons of c-fos mRNA in each of layers divisions of the striate cortex in normal and strabismic cats(cell·mm －2)

3 討論

切斷幼貓的外直肌，在術(shù)后4 wk后能觀察到手術(shù)眼內(nèi)斜視22°～35°，P-VEP檢測(cè) P100峰潛時(shí)，P100波幅值與對(duì)照眼比較，均有明顯的潛時(shí)延長(zhǎng)和波幅下降(P<0.05)，說(shuō)明斜視貓模型視路神經(jīng)元生理特性己經(jīng)發(fā)生改變，斜視性弱視貓模型建立成功。

PVEP是給與視覺(jué)刺激后，在枕骨所記錄到誘發(fā)的生物電信號(hào)，反映了視覺(jué)信號(hào)從視網(wǎng)膜傳導(dǎo)到視覺(jué)中樞的生物電活動(dòng)，它主要反映視網(wǎng)膜、視路和視皮質(zhì)的功能。弱視眼視皮質(zhì)中樞對(duì)圖形運(yùn)動(dòng)感覺(jué)及邊界對(duì)比效應(yīng)敏感的神經(jīng)元存在異常［2～4］，所以弱視眼圖形VEP檢查可出現(xiàn)明顯的空間對(duì)比及時(shí)間特征方面的異常，與對(duì)側(cè)眼或正常眼相比，可出現(xiàn)潛伏期延長(zhǎng)及振幅降低［5，6］。Cleland 等［7］通過(guò)微電極技術(shù)測(cè)得弱視貓視皮質(zhì)17區(qū)神經(jīng)元空間敏感度下降與P-VEP改變相符。所以，P-VEP可以作為衡量弱視視皮質(zhì)功能狀態(tài)的間接依據(jù)，在弱視的診療中具有重要作用，而在基礎(chǔ)研究中主要用于探討弱視發(fā)生的機(jī)制及觀察藥物的作用［8］。本實(shí)驗(yàn)中正常貓的波形規(guī)整，有明顯的波峰。MC組潛時(shí)延長(zhǎng)，左右眼振幅比值降低，與正常組比較差異有顯著性;治療各組P100波幅值提升、P100峰潛時(shí)縮短，且與模型對(duì)照組比較差異有顯著性，說(shuō)明治療藥物左旋多巴甲酯不僅可以改善斜視性弱視貓的視敏度和視覺(jué)傳導(dǎo)功能，斜視眼視功能有所恢復(fù)。其可能的機(jī)制:左旋多巴甲酯結(jié)構(gòu)上與左旋多巴相似，其作用機(jī)制應(yīng)該相似，左旋多巴是多巴胺的前體，多巴胺不能通過(guò)血腦屏障，而左旋多巴可穿過(guò)血腦屏障并轉(zhuǎn)化為多巴胺，發(fā)揮其藥理作用。故我們推測(cè)左旋多巴甲酯可能通過(guò)以下途徑發(fā)揮作用:其一，弱視的發(fā)生可能與眼局部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)濃度相對(duì)不足，不能有效地傳導(dǎo)該眼視覺(jué)細(xì)胞的神經(jīng)沖動(dòng)，造成視通道傳導(dǎo)處于一種廢用性休眠狀態(tài)有關(guān)。通過(guò)給予脂溶性良好的LDME，LDME很容易進(jìn)入腦內(nèi)從而提高視覺(jué)通路DA的濃度，激活休眠狀態(tài)的錐細(xì)胞及其視通道的功能，改善了該眼視路信息傳導(dǎo)的狀態(tài)，從而延長(zhǎng)或恢復(fù)了視覺(jué)發(fā)育敏感期。另外，DA參與敏感期視皮質(zhì)的發(fā)育，DA及兒茶酚胺代謝可以解除弱視眼的皮質(zhì)抑制，從而改善視功能。

視皮質(zhì)c-fos基因能夠?qū)ν挥|刺激產(chǎn)生快速、短暫的表達(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞過(guò)程的調(diào)節(jié)，視皮質(zhì)c-fos基因反映神經(jīng)細(xì)胞興奮性的變化［9］。作為第一信使的外來(lái)刺激作用于胞膜上的受體，激活膜內(nèi)的第二信使，后者與相應(yīng)受體結(jié)合后產(chǎn)生興奮性突觸電位，引起神經(jīng)元的興奮，從而激活c-fos基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA逸出胞核到達(dá)胞質(zhì)，翻譯成Fos蛋白，并進(jìn)一步與Jun蛋白結(jié)合形成異源二聚體－激活蛋白-1(AP-1)，該異聚體蛋白重新轉(zhuǎn)位至核內(nèi)后，結(jié)合到靶基因的DNA調(diào)節(jié)區(qū)，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子進(jìn)而控制晚期反應(yīng)基因的表達(dá)，發(fā)揮信使作用，從而將細(xì)胞外的信息轉(zhuǎn)換成細(xì)胞的一種持續(xù)功能變化［10，11］。谷氨酸受體、鈣離子和cAMP的作用影響著該過(guò)程。出生后早期視覺(jué)環(huán)境通過(guò)影響神經(jīng)元受刺激的水平來(lái)影響視皮質(zhì)內(nèi)cfos mRNA的表達(dá)。在視皮質(zhì)內(nèi)，c-fos mRNA的基礎(chǔ)水平均較低［12］，所以在暗環(huán)境下，免疫反應(yīng)性不會(huì)有明顯的改變而恢復(fù)自然環(huán)境短暫的時(shí)間后，c-fos mRNA會(huì)出現(xiàn)快速急劇短暫的增加，其數(shù)量相當(dāng)于基礎(chǔ)水平的4倍［13］。本試驗(yàn)預(yù)先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入暗室內(nèi)飼養(yǎng)48 h，然后暴露于正常視覺(jué)環(huán)境2 h，以誘導(dǎo)c-fos基因的快速轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)中各治療組c-fos mRNA在斜視性弱視貓視皮質(zhì)各層神經(jīng)元的表達(dá)均增多，除在Ⅳ外，與模型組比較其余各組差異有顯著性(P<0.05)，說(shuō)明給藥后視皮質(zhì)各層神經(jīng)元出現(xiàn)一定程度恢復(fù)，甚至高劑量組在Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ層與正常組比較，差異均無(wú)顯著性(P>0.01)。提示c-fos mRNA能夠反映視皮質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。陽(yáng)性對(duì)照組用藥后，c-fos mRNA在斜視性弱視貓視皮質(zhì)各層神經(jīng)元的表達(dá)均增多，與左旋多巴甲酯低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與左旋多巴甲酯中、高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。說(shuō)明這兩個(gè)劑量組貓視皮質(zhì)各層神經(jīng)元的表達(dá)或功能狀態(tài)恢復(fù)比陽(yáng)性對(duì)照組好。據(jù)此，我們推測(cè):左旋多巴甲酯改善視功能可能與其介導(dǎo)視皮質(zhì)c-fos基因的表達(dá)調(diào)控有密切關(guān)系，至于通過(guò)何種途徑尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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