蘇云金芽孢桿菌新型營養期殺蟲蛋白Vip3研究進展

摘 要:營養期殺蟲蛋白是由蘇云金芽孢桿菌在營養生長對數中期至穩定期期間分泌產生的一類新型殺蟲蛋白。Vip根據蛋白質序列同源性主要分為三類:Vipl、Vip2和Vip3，以Vip3的研究最為深入，VIp3對鱗翅目害蟲具有很高的殺蟲活性。本文就Vip3的類型和殺蟲活性、作用機理、基因的定位和分離、基因重組和轉vip3基因植物等方面詳細介紹vip3近十年來的研究進展。

關鍵詞:蘇云金芽孢桿菌(Bt) 營養期殺蟲蛋白Vip3 vip3基因

1 Vip3的發現及其特性

隨著研究的深入，更多的Bt生物活性因子被發現，如磷脂酶、免疫抑制劑、外毒素。營養期殺蟲蛋白就是其中之一。1996年Warren在蠟狀芽孢桿菌AB78菌株中首先發現營養期殺蟲蛋白，最早在成菌株中發現的vip是Estruch等1996年發現的vip3Aa和vtp3Ab。而VlPs的命名不一定準確，因為某些伴孢晶體也可以在營養生長期形成，如Cry3A。與lCPs不同，vip從對數生長中期開始分泌，直到穩定前期達到最高峰。它與蘇云素不同，具有熱不穩定性，它并不形成晶體，在氨基酸序列的進化上與lCPs沒有任何同源性，是一類新型的殺蟲蛋白。基于vlp在農作物蟲害防治和抗性控制管理中的重要意義，各國科學家爭相發展各種方法發掘資源，根據蛋白質序列的同源性，vip基因分vipl、vip2和vip3三種，其中以vip3的研究較為深入。

2 Vip3殺蟲機理

關于vip3作用機理的研究已較為深入。細胞病理學試驗表明:敏感昆蟲(如BCW)喂食vip3A(a)蛋白24h后，中腸上皮柱狀細胞膨脹成圓形，而杯狀細胞的形態稍有變化;48h后，內腔充滿崩潰細胞的碎片，杯狀細胞明顯受損，但它和柱狀細胞仍然與基膜相連;72h后，與基膜完全脫落，昆蟲死亡。Vip3A引起的癥狀與ICPs的相似，但是時間上推遲了，后者則只需16-24h。而兩者的作用機制則完全不同:ICPs在昆蟲堿性中腸中溶解，前毒素經中腸胰蛋白酶作用后，將C-端切除，加工成對昆蟲有活性的毒蛋白，毒蛋白再與中腸上皮細胞刷狀緣膜(brush border membrane vesicles，BBMv)的受體結合，引起昆蟲細胞膨脹解體，導致昆蟲死亡。Vip3殺蟲機理主要體現在毒素對昆蟲中腸細胞的破壞。Vip3A毒蛋白在pH值5.0到10.0之間為可溶解蛋白，它們以可溶性蛋白的形式進入昆蟲消化系統。進入中腸后，經過蛋白酶作用，形成22kD、33kD、45kD和62kD的蛋白。其中，62kD的蛋白是起作用的核心蛋白，33kD和45kD是62kD核心蛋白降解后的條帶。電壓鉗分析實驗表明:全長的vip3Aa蛋白無法在煙草天蛾中腸細胞上形成穿孔，只有62kD的核心蛋白才能與中腸上皮細胞的受體蛋白結合，形成離子通道進行穿孔，誘發昆蟲細胞凋亡，細胞核溶解，最終導致昆蟲死亡。這個推測機制與成孔機制并未完全排斥，因為諸如氣單胞菌素或葡萄球菌屬“一毒素等所致的成孔，也可誘導細胞凋亡性的反應發生。研究表明，對vlp3A蛋白來說，對某種害蟲是否具有殺蟲活性并不是與害蟲腸液能否將蛋白消化成有活性形式有關，而是與害蟲有沒有蛋白作用受體有關，推測不敏感昆蟲體內沒有合適的vip3A蛋白受體。目前對vip3A蛋白受體知之甚少。Vip3A具有明顯不同于ICPs的受體和作用方式，因此研究和利用vip3A，對于拓寬殺蟲譜，提高殺蟲毒力，或者利用與其它毒素協同作用來防止昆蟲產生抗性具有重要意義。

3 Vip3在轉基因抗蟲植物中的應用

viD3新菌株、新殺蟲特性、新殺蟲蛋白及其編碼基因的發現和報道層出不窮，為構建轉基因植物提供了新的殺蟲基因資源，vip3A(a)基因可以全序列或以毒性片斷導入植物。現在Vips已經成功地應用于轉基因殺蟲植物的構建，先正達公司已成功地將vip3A導入不同作物，得到高效抗蟲多價轉基因玉米、棉花，延緩了抗性發展。2004年，先正達公司將轉包括該基因的多價轉基因棉花在美國進行田間釋放試驗，大大提高了植物的抗蟲性，降低了防治費用，減少了環境污染，降低了損失，顯示了很好的應用前景。

Syngenta公司將vip3Aa20基因通過農桿菌介導轉入棉花中獲得的轉基因棉COTl02進行注冊，該轉基因棉對鱗翅目害蟲如棉鈴蟲、煙蚜夜蛾、粉紋夜蛾、秋粘蟲、甜菜夜蛾等均具有較高抗性。沈志成等將泛素啟動子和具有植物密碼偏好的vip3基因使用基因槍法或農桿菌介導法進行水稻轉化，結果表明轉基因愈傷組織對稻縱卷葉螟、二化螟、玉米螟和秋粘蟲有100%的殺蟲活性;而融合cry基因和vip3基因構建的植物表達載體轉入水稻中，也獲得對二化螟和稻縱卷葉螟有抗性的轉基因水稻。

3.1 植物vip3轉基因方法

目前，轉vip3基因植物的構建，主要采用的是農桿菌介導轉化-法和基因槍法。農桿菌介導轉化法主要適合于雙子葉植物，它的原理是利用農桿菌的腫瘤誘導質粒(Ti)上的可轉移DNAfr DNA)區，在農桿菌侵染植物時插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中表達。基因槍轉化法具有無宿主限制、受體類型廣泛、可控程度高、操作簡便快速等突出優點，但與農桿菌轉化法相比，其轉化率較低。而且穩定遺傳的比例小，成本也比較高。顯然農桿菌介導轉化法具有許多優點:轉化頻率高，可導入大片段的DNA，基因拷貝數低，表達效果好。而且農桿菌轉化方法使用的技術和儀器簡單，是且前應用的比較廣泛的方法。

3.2 Vip3基因的分子設計

通過植物基因密碼子偏愛性設計、啟動子優化、基因融合構建等途徑進行vip3基因分子設計，是提高VlP蛋白殺蟲活性，擴大殺蟲譜，降低交互抗性的重要策略。不同的啟動子在不同物種中對基因表達量的影響也很大，在單子葉植物中，可以選擇玉Ubiquibin-1啟動子、水稻actln啟動子等進行構建，而在雙子葉植物中，可以選擇CaMV35S啟動子、Apdopsis的Ubjquitin一3啟動子。將vip3和cry基因構建成雜交基因或融合基因，轉入目標植物共同表達是轉vip3基因培育抗蟲植物的常見策略。此后的轉基因作物，多是將cry基因和vip基因轉入目標植物共同表達。

3.3 VIP蛋白及轉vip3基因植物的安全性參考Peng等為了對含有VIP蛋白的成菌株的毒性進行評估設計了一個實驗。該實驗用含有vlp基因的Bt粉劑喂食Wistar大鼠。急性實驗數據和亞急性實驗數據表明，吞食粉劑的大鼠沒有出現明顯的不良反應，各項生理指標也沒有受到明顯的影響，這說明了含有vip3基因的Bt粉劑對哺乳動物是沒有危害的。轉vJp3基因植物的安全性測定也早已經開始進行。還有研究表明，轉vip3基因作物對靶標昆蟲具有很明顯的殺蟲活性，而對非靶標昆蟲的影響較小。

參考文獻:

[1]韓麗珍，劉辰，謝柳，李有志，蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白VIP3研究進展，基因組學與應用生物學，2009.

[2]劉辰，謝柳，張文飛新型成殺蟲蛋白:VlP殺蟲的機理與植物轉基因應用。分子植物育種，2008