生物熒光法檢測結(jié)核分枝桿菌ATP含量

科研項目 河南醫(yī)學科技攻關(guān)項目，項目編號:2006149

摘 要 目的:建立生物熒光技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌ATP含量的方法并觀察幾種抗結(jié)核藥物異煙肼和利福平的作用。方法:結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv的菌懸液，經(jīng)高溫裂解，提取ATP，用生物熒光技術(shù)檢測ATP含量。條件穩(wěn)定后，觀察菌數(shù)和ATP濃度的關(guān)系，以及加入不同濃度的抗結(jié)核藥物后1周之內(nèi)ATP的動態(tài)變化。結(jié)果:菌液加入裂解液后100℃煮沸8分鐘，迅速降至室溫，加入熒光素酶，3～5分鐘時測熒光值。按上述步驟提取和測定時菌數(shù)和ATP濃度成正比關(guān)系。含藥液體培養(yǎng)情況:隨藥物濃度增加，ATP量下降，培養(yǎng)至第7天時，藥物的敏感性可以初步進行判斷。結(jié)論:所建立的生物熒光法檢測結(jié)核分枝桿菌ATP含量，具有簡便、快速、敏感、可重復性強等特點，有望成為結(jié)核菌體外藥敏試驗的一種有用的方法。

關(guān)鍵詞 結(jié)核菌 三磷酸腺苷 生物發(fā)光法 藥物敏感性試驗

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.208

耐多藥結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核的傳播是我國結(jié)核病控制中的一大難題[1]。由于結(jié)核菌生長緩慢，常規(guī)藥敏試驗耗時長，需2～3個月，影響了耐藥結(jié)核病的早期診斷和合理治療方案的制定[2]，因此很有必要探索一些快速藥敏試驗的方法。ATP是活細胞內(nèi)的一種特殊的能量載體，國際上通常用ATP的檢測來判斷活的微生物水平。本研究即是以生物熒光法檢測結(jié)核分枝桿菌ATP含量并觀察抗結(jié)核藥物的影響，為進一步藥敏試驗的建立奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

菌株情況:本院檢驗科凍存的結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv(ATCC25618)，先在改良羅氏培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)3周，菌塊研磨后置液體培養(yǎng)基Middlebrook 7H9內(nèi)混懸，調(diào)整到麥氏濁度0.5～1.5后，于37℃培養(yǎng)5天時使用。

試劑與儀器:熒光檢測儀(Hygiena International公司產(chǎn)品，Pi-102型)，裂解液，熒光素酶為其配套產(chǎn)品。

ATP測定方法:菌液50ul，加入50ul裂解液，100℃水浴煮沸8分鐘后，迅速降至室溫，轉(zhuǎn)移入專用測試管中，加入100ul熒光素酶，混勻，3～5分鐘時測試熒光值(relative light units，RLU)。

ATP藥敏試驗法初步探索:同樣濃度的菌液分成若干份，各50ul，分別加入異煙肼(INH)、利福平(RFP)，每種藥物各設(shè)3種濃度和空白對照，INH(0，0.01，0.1，1.0ug/ml)，RFP(0，0.01，0.1，1.0ug/ml)。37℃培養(yǎng)0，1，3，5，7天時分別用上述方法測定ATP值。