熒光定量聚合酶鏈式反應聯合檢測性病病原微生物

摘 要 目的:探討熒光定量PCR聯合檢測性病病原體的臨床價值。方法:用熒光定理PCR(FQ-PCR)方法，對淋球菌(NGH)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、梅毒螺旋體(TP)4種性病病原微生物進行定量測定，并與定性PCR比較。結果:兩種PCR方法對NGH、CT、UU、和TP四種病原體檢測的總符合率分別為94.83%、89.02%、95.79%、和95.65%，陽性率差異分別為1.72%、1.22%、2.11%和0，兩種方法陽性率差異均無顯著性意義(P>0.05)。陽性標本定量平均拷貝數對數分別為6.71±3.36、5.56±2.48、6.83±3.17和4.89±3.52。結論:FQ-PCR操作簡便、快速，并能準確定量。對于性傳播疾病的診斷、病情的發展和預后監測、療效評價、指導用藥均具有很高臨床應用價值。

關鍵詞 聚合酶鏈式反應 熒光定量 病原微生物

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.200

熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測技術融匯了PCR技術高效的核酸擴增，探針雜交技術的高敏感、高精致定量的優點。完全封閉操作，儀器直接讀取PCR熒光信號的變化以獲得定量的結果，定量范圍(可包括0～108個基因拷貝/μl);并能克服常規PCR僅能定性無法定量、溴化乙錠染色劑對人潛在致癌污染環境等缺點。目前擴增不同的目的DNA片段通常有不同的擴增溫度條件[1]，FQ-PCR在同一條件下聯合擴增檢測多種病原微生物的報道較少。流行病學調查顯示，我國性傳播疾病(STD)發病率正逐年上升[2]。選擇快速、敏感、特異的檢測手段STD的治療和整體控制非常重要。

資料與方法

2007年2月～2009年2月收治婦科、泌尿外科、皮膚性病門診臨床泌尿生殖系統感染以及懷疑性傳播疾病(STD)或自述有高危接觸史患者620例，其中男256例，年齡17～58歲，平均36歲;女364例，年齡16～49歲，平均26歲。

檢測儀器和試劑:Presonal cycler基因擴增(德國Biometra)，DA260型熒光定量測定儀(上海棱光);熒光定量PCR試劑由廣州達安基因公司提供，PCR定性試劑由洛陽華美公司提供。

方法:①模扳制備:男性尿道拭子或女性宮頸及陰道分泌物拭子放1.5ml無菌生理鹽水(NS)的無菌試管中，在旋渦振蕩器上混勻3份，將混懸液倒入1.5ml 12000rpm/分5份，棄上清，沉淀加等體積(一般50μl)DNA提取液，充分混勻后置沸水浴10分鐘，冷卻后10000rpm/分5分，取上清2μl加入熒光定量擴增管進行擴增。②PCR擴增:93℃預變性120S，然后按93℃ 45秒，55℃ 120秒2個循環，3分鐘后取出迅速放入熒光檢測儀做標本底熒光測定，然后按93℃ 45秒，38個循環后置33保溫，20分鐘內進行熒光強度檢測，結果超過5×102拷貝/μl為陽性。定性PCR擴增條件:取5μl至40μlPCR反應體系，98℃預變性180秒，加入2Μtaq酶，92℃ 30秒，54℃ 45秒，72℃ 60秒，35個循環，72℃ 5分。擴增產物取10μl進行瓊脂糖電泳，電泳結束置紫外透照儀下參照陽性Maker 觀察比對熒光條帶結果。