血漿EBV DNA水平的動力學監測在鼻咽癌放療過程中的意義

摘 要 目的:探討鼻咽癌患者在放療過程中外周血EBV DNA水平的動態變化規律及與臨床療效的關系。方法:運用熒光定量PCR技術動態檢測44例鼻咽癌患者放療期間血漿EBV DNA水平，放療期間每周的第1天檢測1次;臨床觀察放療過程中鼻咽部腫瘤消退情況與外周血EBV DNA水平變化的關系。結果:放療完成2周時，血漿EBV DNA陽性率及拷貝數較前顯著下降，其余各周之間陽性率及拷貝數均無明顯差異。放療過程中血漿EBV DNA水平變化表現為3種動力學曲線形式。每周臨床觀察鼻咽腫塊消退情況發現:隨著放療劑量增加，鼻咽腫塊逐漸縮小，血漿EBV DNA水平逐漸下降。結論:放療過程中血漿EBV DNA水平變化與鼻咽癌患者臨床療效關系密切，同時有可能成為監測鼻咽癌患者放療后復發、轉移的腫瘤標記物。

關鍵詞 鼻咽癌 EBV DNA 熒光定量 PCR

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.209

本實驗將對鼻咽癌放療期間血漿EBV DNA水平的動力學進行研究，明確放療過程中患者外周血EBV DNA水平的動態變化規律與臨床療效的關系，為臨床采用外周血進行治療后監測提供參考。

資料與方法

2005年6月～2007年12月收治鼻咽癌患者44例，男34例，女10例，平均50歲，Ⅲ期患者30例(68.18%)，Ⅳ期患者14例(31.82)。治療前均接受鼻咽、頸部CT掃描、電子鼻咽鏡檢、胸片、腹部B超及相關實驗室檢查以明確分期及除外遠處轉移。所有患者均接受體外根治性放療，鼻咽部劑量70～76Gy，頸部劑量66～70Gy，頸部預防量50Gy。

標本收集:所有患者在治療期間每周的第1天采血1次，第1次采血時間為治療前1周內，最后1次放療前為放療結束時。整個治療過程中共采血8次，每次抽取外周血2ml，加入EDTA抗凝管，離心后吸取血漿于-20℃凍存待測。共收集血樣352份。

檢測方法:運用熒光定量PCR法檢測患者血漿EBV DNA水平。使用EB病毒(EBV)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒，操作嚴格按說明書進行。

擴增的目的基因來自EB病毒EBAN-1片段(109151-109435)，片段長284bp。上、下游引物分別為:5'-GTAGAAGGCCATTTTCCAC-3'、5'-TTTC-TACGTGACTCCTAGCC-3。'在PCR反應體系中加入一個雙末端標記的熒光探針，探針序列為5'-(FAM)ACCACCCGTGGCCCAGATGG(TAMRA)-3'。每批PCR 反應設置陰性對照，強陽性對照(1.0×106～2.0×107copies/ml)，臨界陽性對照(2.0×102～2.0×104copies/ml)，陽性標準品稀釋成不同濃度梯度106、105、104、103、102copies/ml)，進行PCR擴增。PCR反應總體積50μl，含有10μl的5×buffer，引物、探針各0.5μl，dNTP共0.5μl，Taq酶1μl，DNA模板5μl，吸取抽提的DNA5μl入PCR反應管中，在GE- 5700實時熒光定量PCR儀中進行擴增反應，反應條件為93℃2分鐘，1循環;93℃，45秒→55℃，60秒，10循環;93℃，30秒→55℃，45秒，30循環。反應結束后，用計算機將樣本和標準曲線對比，計算出反應體系中待測標本中的DNA拷貝數。

臨床療效觀察:治療期間每周臨床檢查患者鼻咽腫瘤消退情況，在放療完成40Gy和70Gy時行鼻咽CT及電子鼻咽鏡檢查以了解鼻咽腫塊退縮情況。