游離脂肪酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 探討游離脂肪酸(FFAs)對大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)的凋亡作用及凋亡機(jī)制。方法 用含有不同濃度(0、125、250、500μM)軟脂酸的DMEM-F12培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)，在24h、48h兩個(gè)時(shí)段以原位末端標(biāo)記(TUNEL法)檢測細(xì)胞凋亡率，用硝酸還原酶法測定以上各組培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)水平。在48h時(shí)段用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果 隨著軟脂酸濃度的增高、作用時(shí)間的延長:①NRK-52E細(xì)胞的凋亡率逐漸增高，24h時(shí)三個(gè)軟脂酸組按軟脂酸濃度由低到高的凋亡率依次為(9.7±1.9)%、(14.2±4.5)%、(23.4±5.3)%，48h時(shí)為(16.2±3.7)%、(24.8±4.4)%、(35.4±5.7)%，與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);②在凋亡率增高組的培養(yǎng)液中測得NO濃度也增加，差異均有顯著性(P<0.05)。③48h時(shí)各軟脂酸干預(yù)組caspase-3陽性表達(dá)率增高，與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 游離脂肪酸具有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用，而這種作用與其自身在FFAs作用下產(chǎn)生過多的NO使caspase-3高表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 游離脂肪酸;近端腎小管上皮細(xì)胞;一氧化氮;凋亡;caspase-3

[中圖分類號] R329.2+5[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-9701(2010)12-06-03

Free Fatty Acid-induced Apoptosis of Renal Tubular Epithelial Cells:An Experimental Study

LI Yuan1LIU Xiaoling2LI Rongshan2BAI Bo2HAN Le1

1. Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2. The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To observe the effect and mechanism of free fatty acid(FFAs)on apoptosis of proximal renal tubular epithelial cells. Methods Rat renal tubular epithelial cells(NRK-52E) were cultured with DMEM-F12 at different concentrations of palmitic acid(0，125，250 and 500μM)at 24h and 48h，respectively. The percentage of apoptotic cells was assessed by Tunel and Nitrate reduction test was used to measure NO content of the medium. Caspase-3 expression was detected by immunocytochemistry method at 48h. Results As the palmitic acid concentration increased and the reactive time prolonged，the apoptosis rate of NRK-52E cells was gradually increased， at 24 h the apoptosis rates of the three palmitic acid groups at the concentrations of palmitic acid from low to high were(9.7±1.9)%， (14.2±4.5)% and (23.4±5.3)%， at 48h(16.2±3.7)%，(24.8±4.4)%，(35.4±5.7)% and they were significantly different from the apoptosis rate of the control group(P<0.05). The NO concentration was also increased in the culture medium in the increased apoptosis rate group，with a significant difference(P<0.05). The caspase-3 positive expression rate was increased in the palmitic acid intervention groups at 48h，with a significant difference(P<0.05). Conclusion Free fatty acid is capable of inducing rat proximal renal tubular epithelial cell apoptosis，Which is closely related to the high expression of caspase-3caused by the excess NO generated with the FFAs effect on it.

[Key words] Free fatty acid;Proximal renal tubular epithelial cells;NO;Apoptosis;Caspase-3

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是高發(fā)的糖尿病慢性并發(fā)癥，糖尿病終末期腎病占到所有終末期腎病的30%以上，細(xì)胞凋亡在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用。2型糖尿病常伴血脂代謝紊亂，血清游離脂肪酸濃度隨著血糖的異常發(fā)生改變，伴隨空腹血糖水平的升高而升高[1]。FFA異常增多可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)正是觀察不同濃度的軟脂酸對大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)凋亡及凋亡信號蛋白caspase-3的影響，探討FFAs導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料

大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)由中山大學(xué)余學(xué)清教授惠贈，軟脂酸、EMDE-F12培養(yǎng)基購于Gibco公司，新生胎牛血清購于杭州四季青生物公司;去脂牛血清白蛋白(d-BSA);NO檢測試劑盒購自南京建成公司，凋亡試劑盒、DAB顯色劑、caspase-3多克隆抗體(濃度為1∶150)及生物素化羊抗兔IgG及均購自博士德公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM-F12為NRK-52E細(xì)胞的培養(yǎng)液，在含5%CO2濃度37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，細(xì)胞傳至第四代處于生長對數(shù)期時(shí)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2分組方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)立五組(1)軟脂酸干預(yù)組設(shè)三組:以去脂牛血清白蛋白(d-BSA)為溶解軟脂酸的載體，以加入培養(yǎng)液中軟脂酸濃度的不同分為125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L，(各組載體d-BSA含量為0.125%、0.25%、0.5%);(2)對照組設(shè)兩組:①正常培養(yǎng)液組②0.5%d-BSA+正常培養(yǎng)液組。

1.2.3硝酸還原酶法分別測定NO常規(guī)消化、收集NRK-52E細(xì)胞，按每孔1×105接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化細(xì)胞，加入不同濃度軟脂酸繼續(xù)培養(yǎng)，在0h、24h、48h時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液各100μL，-20℃儲存用硝酸還原酶法測定各組NO含量。

1.2.4原位末端標(biāo)記(TUNEL法)檢測細(xì)胞凋亡水平按每孔1×105接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱細(xì)胞爬片培養(yǎng)24h，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化細(xì)胞后，加入不同濃度軟脂酸繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h進(jìn)行實(shí)驗(yàn):先用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛室溫下固定30min，按照tunel凋亡檢測說明書操作。再用蘇木素輕度復(fù)染正常細(xì)胞，凋亡的細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、胞核固縮呈黃色，正常細(xì)胞形態(tài)正常胞核呈藍(lán)色。從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞。在400倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/400倍視野中細(xì)胞總數(shù)×100%，每張片隨機(jī)取9個(gè)視野，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組觀察5張片。

1.2.5免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測caspase-3按每孔1×105接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱細(xì)胞爬片培養(yǎng)24h，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化細(xì)胞后，加入不同濃度軟脂酸繼續(xù)培養(yǎng)，在48h進(jìn)行實(shí)驗(yàn):先用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛室溫下固定30min，PBS洗2次，蒸餾水洗3次，3%H2O2處理5min，蒸餾水洗3次，5%BSA封閉20min，甩去不洗加一抗4℃濕盒過夜，PBS洗3次，加二抗(生物素化羊抗兔IgG)37℃反應(yīng)20min，PBS洗3次，加SABC37℃反應(yīng)20min，PBS洗4次，DAB顯色10~20min，蘇木素輕度復(fù)染，蒸餾水洗。風(fēng)干、封片。400倍倒置顯微鏡觀察:細(xì)胞胞質(zhì)成棕黃色者為陽性細(xì)胞。caspase-3表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/400倍視野中細(xì)胞總數(shù)×100%，每張片隨機(jī)取9個(gè)視野，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組觀察5張片。

2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)間比較行t檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1一氧化氮測定

見表1。表1顯示，正常培養(yǎng)液組和d-BSA組培養(yǎng)液中NO濃度無明顯升高，各軟脂酸處理組在第24小時(shí)、48小時(shí)NO均明顯增高，其中各軟脂酸處理組與0h組相比，在第48小時(shí)表現(xiàn)出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

3.2TUNEL原位凋亡檢測

見表2。表2顯示，NRK-52E細(xì)胞在正常培養(yǎng)液組、d-BSA組培養(yǎng)，在24h、48h兩個(gè)時(shí)段都有少量凋亡細(xì)胞，兩對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各軟脂酸處理組細(xì)胞凋亡率明顯增高，與正常培養(yǎng)液組和d-BSA組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度軟質(zhì)酸組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同濃度軟脂酸組，24h與48h組間比較，48h組凋亡率高于24h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測

見圖1。圖1顯示，NRK-52E細(xì)胞在正常培養(yǎng)液組、d-BSA組培養(yǎng)，48h都有少量細(xì)胞caspase-3表達(dá)，兩對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各軟脂酸處理組細(xì)胞caspase-3表達(dá)率明顯增高，且具有濃度依賴趨勢，和48h時(shí)的細(xì)胞凋亡率基本一致，與正常培養(yǎng)液組和d-BSA組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4討論

隨著現(xiàn)代生活水平的提高、生活方式的改變，肥胖、高血壓、高血脂、高血糖為特征的代謝綜合征患病率逐年上升。脂質(zhì)代謝的異常存在于上述各類疾病中[2]，但以往對血脂的研究重點(diǎn)主要集中在心血管的損傷作用上，近年有學(xué)者報(bào)道，蛋白尿的腎毒性可能是由結(jié)合在蛋白上的脂質(zhì)介導(dǎo)，其中游離脂肪酸(FFAs)起重要的作用[3，4]。游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)是指非酯化的脂肪酸(nonesterified fatty acid，NFFA)，是脂肪代謝的中間產(chǎn)物，在血中與白蛋白結(jié)合運(yùn)輸，可隨尿白蛋白經(jīng)過腎小管，為FFAs導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損害提供了基礎(chǔ)。正常腎小管上皮細(xì)胞具有旺盛的代謝活性和修復(fù)能力，并能分泌多種細(xì)胞因子，在病理狀態(tài)下，也容易發(fā)生結(jié)構(gòu)、功能的損傷。莫湛宇等人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FAs有促進(jìn)腎小管表型轉(zhuǎn)化腎小管間質(zhì)纖維的作用[5]。FFA的長期作用還可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，包括胰島β細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞[6]和睪丸Leydig細(xì)胞[7]等。

我們采用體外干預(yù)的方法，以白蛋白為載體用含不同濃度軟脂酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)發(fā)現(xiàn)在軟脂酸濃度增高和干預(yù)時(shí)間的延長時(shí)，細(xì)胞凋亡率增加，在48h測得各軟脂酸干預(yù)組細(xì)胞中caspase-3陽性表達(dá)率與細(xì)胞凋亡率基本一致，而凋亡率增高組培養(yǎng)液中NRK-52E細(xì)胞NO的分泌量也顯著增加。而d-BSA組和正常培養(yǎng)液組相比在對NRK-52E細(xì)胞的凋亡作用上沒有差別，排除了作為FFA載體的小劑量白蛋白(<5mg/mL)在內(nèi)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，我們認(rèn)為FFA是本實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的因子。而NRK-52E細(xì)胞的凋亡可能與FFA誘導(dǎo)其自身分泌過多的NO有關(guān)。NO作為一種細(xì)胞內(nèi)生物信使或細(xì)胞毒性效應(yīng)分子介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與其濃度、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和所作用的細(xì)胞類型有關(guān)。高濃度NO可導(dǎo)致多種細(xì)胞凋亡及壞死[8]，我們推測，F(xiàn)FAs的異常增多可以激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)使細(xì)胞生成大量NO，在本實(shí)驗(yàn)軟脂酸干預(yù)組中NO濃度明顯升高可能作為一種化學(xué)性質(zhì)活躍的自由基，NO與超氧陰離子反應(yīng)可生成細(xì)胞毒性作用更強(qiáng)的ONOO-，二者可以通過氧化應(yīng)激激活caspase經(jīng)過一系列級聯(lián)反應(yīng)最終使caspase-3活化，活化的caspase-3是凋亡過程中的主要執(zhí)行者進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9，10]。

綜上所述，游離脂肪酸對腎小管上皮細(xì)胞脂性凋亡作用與其自身在FFAs作用下產(chǎn)生大量NO有關(guān)，caspase-3作為重要的效應(yīng)因子在腎小管上皮細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。

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(收稿日期:2010-01-26)