MMP-2\\COX-2與VEGF在膀胱移行細胞癌中的表達及臨床意義

[摘要] 目的探討環氧化酶-2(COX-2)、金屬基質蛋白酶-2(MMP-2)與血管內皮生長因子(VEGF)在膀胱移行細胞癌中的表達及臨床意義。方法采用免疫組化SP法和高清晰度彩色醫學圖文分析系統對38例膀胱移行細胞癌和15例正常膀胱黏膜中COX-2，MMP-2，VEGF的表達進行檢測分析。結果COX-2、MMP-2在膀胱癌中呈高表達，且隨分期、分級的增高而表達增強;VEGF在膀胱癌中亦呈高表達，且與分期呈正相關，但與分級不相關。結論COX-2、MMP-2和VEGF參與膀胱癌侵襲轉移，在膀胱移行細胞癌中的表達對其診斷及預后判斷具有參考價值。

[關鍵詞] 膀胱移行細胞癌;免疫組織化學;金屬基質蛋白酶-2(MMP-2);血管內皮生長因子(VEGF);環氧化酶-2(COX-2)

[中圖分類號] R737.14[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2010)10-12-03

Expression and Significance of MMP-2，COX-2 and VEGF in Bladder Transitional Cell Carcinoma

XING TaoLIU HongyaoYAN PengWANG Zhihua

Department of Urology，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of cyclooxygenase-2(COX-2)，matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and vascular endothelial growth factor(VEGF) in human bladder transitional cell carcinoma and discuss their clinical significance. Methods BY using immunohistochemical stains and BI-2000 analysis system，the expression of COX-2，MMP-2 and VEGF in 38 cases of bladder carcinoma(as tumor group) and their expression in 15 cases of normal bladder(as control group)were analyzed. Results In the tumor group，the expression of COX-2 and MMP-2 was higher and their expression rates increased with the increase in the staging and grading. VEGF was also higher and its expression rates increased with the increase in the staging but not with the increase in the grading. Conclusion COX-2，MMP-2 and VEGF play an important role in the invasion step of bladder transitional cell carcinoma. The detection of their expressions may become a new approach to the diagnosis of urothelial carcinomas.

[Key words] Bladder transitional cell carcinoma;Immunohistochemitry;Matrix metalloproteinase-2;Vascular endothelial growth factor;Cyclooxygenase-2

膀胱腫瘤是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，其中膀胱移行上皮細胞癌占90%以上，其生物學特性是多中心、易復發及浸潤性生長。復發后腫瘤惡性度可增高，浸潤、轉移等行為有增強趨勢。此過程與腫瘤細胞外基質的降解、新生血管的大量形成有密切關系。大量研究表明環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)不僅通過促進細胞增殖、抑制凋亡參與多種腫瘤的發生過程，而且利用不同的途徑來促進腫瘤的浸潤與轉移。在眾多溶解細胞外基質的蛋白水解酶中，基質金屬蛋白酶(MMPs)對腫瘤的浸潤與轉移起著極為重要的作用[1]。VEGF是高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂素和提高血管通透性最強的因子。它能特異地作用于血管內皮細胞，刺激其增生及移行，誘導新生血管的生成。研究還認為，VEGF的高表達與腫瘤患者的生存時間、早期復發、浸潤及轉移等有關[2]。本研究探討環氧化酶-2(COX-2)、基質金屬蛋白酶-2(matrixmetallo proteinase，MMP-2)和血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)在膀胱移行上皮細胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)中的表達及其臨床意義。

1資料與方法

1.1研究對象

收集山西醫科大學第一附屬醫院2006～2008年間原發性BTCC住院手術患者標本38例。所有標本均經病理檢查證實。其中男22例，女16例，年齡36～78歲，平均60.91歲。所有患者術前均未行藥物化療、放射治療、免疫或生物治療。按WHO標準病理分級:G1 14例，G2 13例，G3 11例。TNM分期采用UICC標準:淺表性16例(Tis-T1)，浸潤性22例(T2-T4)。同時以15例附帶癌旁正常黏膜或膀胱鏡下活檢正常的膀胱黏膜作為對照組。

1.2實驗方法

采用SP免疫組化法。具體操作按通用型S-P9706試劑盒說明書進行。一抗分別為鼠抗人COX-2多克隆抗體，鼠抗人MMP-2多克隆抗體和鼠抗人VEGF多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)。主要步驟簡述如下:常規脫臘，水化，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液行微波抗原修復，正常山羊血清封閉，分別滴加COX-2及MMP-2，VEGF多克隆抗體4℃過度，滴加生物素標記二抗及SP復合物孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染，透明，中性樹膠封片。

1.3免疫組化結果判定

用BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)對免疫組化切片進行圖像分析，測量其平均光密度值。

1.4統計學處理

以平均光密度值作為COX-2、MMP-2、VEGF的相對含量，數據以均數±標準差表示，采用SPSS13.0統計軟件對數據進行統計學分析。用t檢驗比較COX-2、MMP-2、VEGF在BTCC和正常膀胱黏膜組織之間表達水平的差異以及不同分化BTCC組織中表達水平的差異。各指標之間的相關性分析用Spearman等級相關分析。

2 結果

正常膀胱上皮MMP-2和COX-2均為陰性表達，VEGF為較低表達。MMP-2和COX-2在腫瘤上皮陽性表達細胞和表達強度分布不均勻，在與間質組織、血管臨界面以及腫瘤侵襲入膀胱深層組織前緣陽性表達細胞多，表達強度也較強。VEGF在腫瘤中的表達細胞及表達強度分布相對比較均勻。膀胱正常組織與膀胱癌組織中COX-2、MMP-2和VEGF的光密度值有顯著性差異(表1)。隨著分級的增加COX-2和MMP-2的光密度值呈遞增趨勢，VEGF的光密度值隨分級的增加未出現遞增趨勢(表2)。COX-2、MMP-2與VEGF的平均光密度值隨腫瘤分期的增加呈遞增趨勢(表3)。COX-2、MMP-2、VEGF在膀胱癌中表達具有相關性(表4)。

COX-2平均光密度值，正常組與膀胱癌組比較，t=6.726，P<0.01;MMP-2組的平均光密度值，正常組與膀胱癌組比較，t= 4.724，P<0.01;VEGF組平均光密度值，正常組與膀胱癌組比較t=6.59，P<0.05。膀胱正常組織與膀胱癌組織中COX-2，MMP-2和VEGF的光密度值有顯著性差異。

Spearman等級相關分析COX-2與MMP-2平均光密度值均與膀胱癌分期呈正相關，相關系數分別為0.745和0.644，均P<0.01;VEGF平均光密度值不與膀胱癌分級相關(r=-0.217，P>0.05)。

Spearman等級相關分析COX-2、MMP-2和VEGF平均光密度值均與膀胱癌分期呈正相關，相關系數分別為0.84、0.75、0.61，三者均P<0.01。

Spearman等級相關分析VEGF平均光密度值與COX-2呈正相關(r=0.73，P<0.01)，與MMP-2亦呈正相關(r=0.56，P<0.01)，COX-2平均光密度值與MMP-2呈正相關(r=0.48，P<0.01)。

3 討論

本實驗顯示，正常膀胱黏膜下及肌肉間隔組織中的COX-2、MMP-2及VEGF呈陰性表達或表達很低，說明在正常膀胱上皮中COX-2和MMP-2及VEGF基本無酶活性。而在膀胱移行細胞癌中，三者的光密度值明顯升高，即它們的表達發生了明顯增強，說明三者的表達水平可用于膀胱癌的診斷。COX-2與MMP-2陽性表達主要位于癌細胞胞漿，細胞間質和部分腫瘤組織間質內，以腫瘤細胞表達為主，胞漿呈不同程度基本均勻的棕色染色，陽性表達主要分布在間質、血管臨界面及癌侵入膀胱深層組織前緣，特別是呈浸潤性生長的癌組織周圍表達較強，而在腫瘤團塊內部陽性細胞相對反而較少。VEGF主要表達于癌細胞及血管內皮細胞。我們也發現，VEGF在膀胱癌中隨腫瘤分期的升高而表達增加，但與腫瘤分級無相關性，說明VEGF的表達只與腫瘤細胞的侵犯的范圍相關，而與腫瘤惡性分化程度關系不大。本研究也顯示腫瘤間質中的COX-2、MMP-2的表達強度多數高于正常間質，且分布不均勻，位于腫瘤細胞的鄰界面表達較高。以上資料說明隨著腫瘤的生長，腫瘤細胞產生COX-2、MMP-2蛋白也越來越多，使其穿透基質的能力明顯增強，有利于腫瘤的轉移，驗證了腫瘤組織中的COX-2、MMP-2在某種程度上參與腫瘤的侵襲和轉移。

本實驗結果顯示，MMP-2與VEGF在膀胱移行細胞癌中的表達呈正相關(r=0.56，P<0.01)，說明在膀胱移行細胞癌中MMP-2和VEGF的表達對腫瘤血管生成可能有協同作用。可能與以下幾個方面的原因有關:①VEGF除可增加血管通透性和促進內皮細胞增殖外，還可以激活MMPs，促進細胞外基質降解，有利于腫瘤血管的新生。②在腫瘤等病理條件下，VEGF強烈地誘導血管生成，同時誘導內皮細胞產生尿激酶型和組織纖溶酶型激活物，增加釋放明膠酶A、B和減少金屬蛋白酶組織抑制劑的釋放，協同促進血管生成[3]。

VEGF與COX-2在膀胱移行細胞癌中的表達呈正相關(r= 0.73，P<0.01)。其可能原因為:①COX-2催化花生四烯酸根生成前列腺素E2(PGE2)，PGE2作用于前列腺受體EP2，使細胞內環磷酸腺苷(cAMP)增加，誘導生成VEGF，促進了腫瘤血管形成。Marrogi等[4]在研究中運用COX-2選擇性抑制劑可顯著抑制腫瘤組織的血管生成。②VEGF作用于內皮細胞表面的受體，同時上調COX-2的表達，促進血管生成。

MMP-2與COX-2在膀胱移行細胞癌中的表達呈正相關(r=0.48，P<0.01)，其可能原因是COX-2通過上調腫瘤組織中MMP-2的表達促進腫瘤血管的生成。目前MMP-2與COX-2在腫瘤中作用相關性研究較少，動物實驗證實，在結、直腸癌中特異性COX-2抑制劑rofecoxib(羅非考昔)可使MMP-2的蛋白水平下降，提示MMP-2有可能是COX-2促進腫瘤發生、發展的途徑之一[5]。

同時有研究顯示COX-2，MMP-2與VEGF在促血管形成方面具有協同作用:COX-2、MMP-2能通過上調VEGF的表達從而促進血管的生成，VEGF通過增加COX-2信使核糖核酸形成和延長COX-ZmRNA活性時間從而促進其表達[6]。國外學者將轉染COX-2基因的結腸癌細胞株和人臍靜脈內皮細胞株聯合培養，結腸癌細胞在高表達COX-2的同時，促進VEGF、bEGF、pDGF等均明顯上調。在內皮細胞中，COX-2的代謝產物PGE2作為重要的促進血管新生的因子可能直接參與了促進血管內皮細胞MMP-2及VEGF的高表達，從而促進了腫瘤組織相關的血管新生，即COX-2/PGE2/MMP-2/VEGF途徑可能參與腫瘤的血管新生[7]。本實驗研究結果顯示，COX-2、MMP-2、VEGF在大部分BTCC組織中呈不同程度的陽性表達，且三者之間具有明顯相關性，為上述研究結果[6，7]提供了支持。

綜上所述，我們認為聯合COX-2、MMP-2和VEGF有望成為膀胱移行細胞癌新的檢測指標。免疫組織化學SP法簡便、快速、直觀，有利于臨床推廣使用，高清晰度彩色醫學圖文分析系統具有客觀、快速的優點，綜合利用這些技術方法分析染色光密度值，對容易出現轉移、惡化的高危患者及早綜合治療，有利于提高患者的生存率。

[參考文獻]

[1] Bhuvarahamurthy V，Kristiansen GO，Johannsen M，et al. In situ gene expression and localization of metalloproteinases MMP1，MMP2，MMP3，MMP9，and their inhibitors TIMP1 and TIMP2 in human renal cell carcinoma[J]. Oncol Rep，2006，15(5):1379-1384.

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[4] Darnton SJ，Hardie LJ，Muc RS，et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase 3 gene is methylated in the development of esophageal adenocarcinoma:loss of expression correlates with poor prognosis[J]. Int J Cancer，2005，115(3):351-358.

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[6] Claffey KP，Robinson GS. Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells: consequences for tumor growth and metastasis[J]. J Cancer Metastasis Res，1996，15:165.

[7] Folkman J. Angiogenesis in cancer， vascular， rheumatoid and other disease[J]. Nat Med，1995，1(1):27-31.

(收稿日期:2010-01-06)