益生菌的篩選及安全性研究進展

曲 巍

(北京靖雪萱健康科技有限公司，北京 100176)

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益生菌的篩選及安全性研究進展

曲 巍

(北京靖雪萱健康科技有限公司，北京 100176)

益生菌作為有益菌，是身體中必不可少的要素之一，與諸多微生物一樣，對人類健康有著諸多益處，可促進營養物質的吸收。在益生菌的科學研究中，其生產、分離等都有著重要的應用價值，在益生菌的培養周期內，高溫狀態更能體現其活躍性。著重對益生菌的篩選分離進行實驗研究，對其安全性研究發展提出見解，以供參考。

益生菌；分離；篩選；安全性；發展

益生菌作為互利共生的微生物，在宿主體內可保障宿主的健康，保障機體有序運行。不同種類的益生菌有著不同的功效和作用，在醫學和食品研究中都有著極其重要的作用，尤其是在保健食品中，對人體健康有著諸多好處。

1 益生菌篩選的具體方法

1.1 培養基

MRS液體培養基；MRS固體培養基；產黏性培養基；葡萄糖產氣培養基；抑菌實驗檢測培養基；V-P反應培養基；溶鈣圈檢測培養基。

1.2 實驗儀器

電熱恒溫隔水式培養箱；數顯恒溫水浴鍋；可見分光光度計；光學顯微鏡；pH計。

1.3 篩選方法

分離純化：將樣品10倍梯度稀釋，涂MRS平板，用石蠟封口，37 ℃厭氧培養24 h，并分離純化。將菌株用甘油管法-20 ℃保藏。溶鈣圈實驗：在溶鈣圈檢測培養基上，點種分離，37 ℃培養72 h，以此初步判斷菌株是否產酸。產氣性實驗：將分離的菌株接種到帶有倒置杜氏小管的葡萄糖產氣培養基中，37 ℃培養24 h。觀察杜氏小管內是否有氣泡產生，同時還可以通過觀察培養液的顏色變化，確定菌株是否產酸，以此進一步判斷是否產酸的標準。黏性實驗：用MRS固體培養基，其中蔗糖代替葡萄糖。接種后于37 ℃培養24 h，用接種針挑取菌落直接觀察。抑菌實驗：在不加乙酸鈉的MRS固體平板培養基上利用混菌法，接種新培養的指示菌(大腸桿菌和葡萄球菌)后，點種分離，37 ℃培養24 h，觀察菌株的抑菌圈。

2 篩選結果與分析

2.1 結果與分析

從樣品中共分離的21株菌(分別編號為1～21，其中1～10來源于樣品1，11～21來源于樣品2)。在分離純化過程中，對單菌落進行了革蘭氏染色、鏡檢。其中編號1～3、6、7、9～11、17～21的13株菌能夠形成鈣溶解圈(以下稱“考查菌株”)。

從篩選分離實驗中可以看出，革蘭氏陰性和陽性的菌株都有溶鈣圈形成，在48 h內都表現出溶鈣圈，且部分菌株在72 h內形成明顯溶鈣圈。所有考查菌株都能形成抑菌圈，且都不產黏性物質。

在產氣性實驗中，編號1、2、6、7、9、20、21的7株菌沒有產生氣泡，3、10、11、17、18、19的6株菌有氣泡產生，且向其培養液中加入過量NaOH，輕搖試管，靜置一段時間，氣泡都不消失，證明所產氣體不是CO2，并觀察培養液顏色發生變化，只有17號菌株，培養液顏色沒有變化，無色，證明其不產酸。因此，確定編號1、2、3、6、7、9、10、11、18、19、20、21的12株菌為產酸益生菌。

2.2 菌株的生長和產酸能力鑒定

將考查菌株接種于MRS液體培養基，37 ℃培養24 h，以MRS液體培養基為空白對照，每4 h用722分光光度計于650 nm測定菌液的OD值，用酸度計測定pH值。

通過數據可以看出：第一，所有菌株在培養8～12 h時，OD值達到最大，編號6、7、10、11、19、20的6株菌生長迅速，1號菌株生長最慢，在12～20 h時達到最大值。第二，pH值數據顯示，除1號菌株外都能降低1～2個點；6、11、19、20、21的5菌株變化最快，4 h后能降低2個點，在培養初期pH值不斷下降，隨著時間的延長，這種下降趨勢逐漸變緩，所有菌株在20 h以后趨于平緩。

2.3 溫度對菌株的生長和產酸能力的影響

用MRS液體培養基，在27 ℃～28 ℃培養24 h，以空白MRS液體培養基為對照，用722分光光度計于650 nm測定菌液的OD值，用酸度計測定pH值。編號2、3、9、10、20、21的6株菌在高溫條件下生長較好，低溫條件下明顯受到抑制。1號菌株表現出更適合低溫條件生長，其菌體濃度高于高溫條件下培養的，pH值顯示在低溫條件下酸度更大。編號6、7、11、18、19的5株菌的OD值和pH值受溫度變化影響不明顯。

3 益生菌的安全性研究進展

3.1 益生菌的安全性研究進展

常用的安全性研究檢驗方法主要有兩種：第一，厭氧研究檢驗法。微生物大多在厭氧環境下易于生存繁衍，因此，應用厭氧狀態對微生物進行培養。微生物在厭氧狀態下繁衍速度加快，而需氧的微生物在無氧狀態下會死亡，這樣在無氧狀態下檢驗就會使益生菌含量提高。在整個實驗過程中，要注意掌握時間，如果檢驗時間過長，檢驗結果就會不準確。第二，體內研究檢驗法。此種檢驗法主要是在益生菌本體的體外利用培養器皿進行益生菌的安全性檢驗。這項安全性檢測技術在我國的益生菌繁衍中還不夠成熟，通常都是用小白鼠進行實驗，通過數周的連續觀察就能得到相關結論。

3.2 益生菌的安全性檢驗方法

作為人體生命活動和身體肌能的應用基礎和主體，益生菌對人類健康具有重要的影響，也是維持人體生命體征穩定運行的有效保證，主要有兩種安全性檢驗方法：第一，重量之差檢驗方法。益生菌是保健食品中必不可少的物質，在人體中發揮著重要的作用，直接關系著人體肌能和生命健康。在重量之差檢驗中，要先烘干，冷卻稱重，記錄第一次的稱重重量，在器皿中倒出上一層的液體，然后對下層液體進行烘干，烘干之后冷卻，置于器皿中稱重。兩次稱重后，將稱重結果進行做差比較。這種檢驗方法檢測準確性較高，但過程較復雜，容易出現失誤。第二，比濁檢驗法。比濁檢驗法是益生菌檢驗中應用比較廣泛的一種，檢測準確度較高，可節省時間和精力。在檢測過程中，檢驗樣品需要稀釋大約數十倍，取出樣品后，在接近人體體溫的溫度下，用厭氧環境進行益生菌培育，大約16 h左右，就可以用600 nm的光罩檢測吸取光值，在兩次光值吸取后做差計算，這種方法檢測的益生菌濃度準確率較高。

4 結語

通過益生菌的篩選試驗，最終得出12株產酸菌，多數菌在培養初期，pH值不斷下降，隨著時間延長，下降趨勢變緩。按理論分析，菌產生有機酸的強度應與時間成正比，但實驗中卻發現有時成反比，這可能與細胞自溶、儀器老舊等因素有關。實驗獲得了6株菌在高溫條件下產酸能力強、1株菌在低溫條件產酸能力強，這些優勢菌株將會繼續篩選。選出生長更好、產酸能力更強的菌株后，如何利用它們，還需要深入研究和探索。

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Research advances in screening and safety of probiotics

QU Wei

(Beijing Jingxuexuan Health Technology Co., Ltd., Beijing 100176, China)

As beneficial bacteria, probiotics is one of the essential elements in body, which can promote the absorption of nutrients. Production and separation of probiotics are found have important application value. In culture cycle of probiotic, its activity can be reflected under the high temperature state. The selection and separation of probiotics were researched, and opinions on its safety research was proposed for reference.

Probiotics; Isolation; Screening; Safety; Development

2016-10-29

曲巍(1982-)，女，碩士研究生，食品工程師。

TS201.3

A

1674-8646(2017)02-0080-02