巨峰葡萄組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

摘要：采用巨峰葡萄腋芽莖段進行組織培養(yǎng)繁育技術(shù)試驗。結(jié)果表明，無菌腋芽莖段誘導叢生芽較適宜的培養(yǎng)基組成為1/2MS+0.03～1.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA，較適宜的根分化培養(yǎng)基組成為1/2MS+0.1mg/LIAA，組培的環(huán)境條件是溫度22～25℃、每日光照14小時和光照強度1800～2000Lx。

關(guān)鍵詞：巨峰葡萄；腋芽莖段；組織培養(yǎng)

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：1002-2910(2011)02-0006-03

葡萄(Vitis vinifera Linn.)為葡萄科(Vitace-ae)葡萄屬(Vitis Linn)多年生藤本植物，世界栽培面積達1000萬hm²，占世界水果產(chǎn)量的30％以上。僅次于柑桔居第二位。葡萄除了鮮食外，可用于釀酒、制干和制汁等，還可作為食品工業(yè)原料，又是美化庭園樓閣、綠化荒山堿灘的觀賞和綠化樹種。

生產(chǎn)上葡萄苗木通常采用枝條扦插法繁育，筆者利用組織培養(yǎng)法將腋芽莖段培育成為試管苗和植株。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與消毒

將通過休眠期的巨峰葡萄枝條插入沙床中催芽，待新梢長出3節(jié)以上時，剪取嫩枝，除去幼葉，剪成1.0～1.5cm長的莖段，每段帶有腋芽或頂芽，作為組培外植體。

取材時用75％的酒精棉球擦洗剪刀，對盛放嫩枝的器械消毒，減少細菌污染。用自來水沖洗莖段2～3小時后，放在無菌水中，置于冰箱內(nèi)，溫度4℃左右處理4小時，取出，用自來水加0.02％的洗潔精浸泡10分鐘，搖動，洗凈材料表面的菌物。將材料轉(zhuǎn)入干凈的三角瓶中，加入75％的酒精，浸泡殺菌20秒鐘，再用蒸餾水漂洗一次，轉(zhuǎn)入經(jīng)過高壓消毒的三角瓶中，加入0.1％的升汞溶液，浸泡殺菌8分鐘，搖動三角瓶，使升汞與材料充分接觸，取出用蒸餾水沖洗4～6次，每次1～2分鐘，除去殘留的升汞。

1.2 接種方法與叢生芽的誘導

芽分化培養(yǎng)基的配制，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，即用MS的大量元素的一半，再附加0.03～0.10mg/LNAA和0.5～1.0mg/L6-BA，配制6種培養(yǎng)基(表1)，用1.0mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.8，加熱到80℃時加入瓊脂粉4.0g/L，煮沸后分裝于100ml的三角瓶中制成培養(yǎng)基，用膜封口，在高壓鍋中高壓滅菌25分鐘后備用。

莖段消毒后，放在消毒濾紙上吸干水分，于莖段原下切面之上0.5cm左右處切一新切面，使之成為0.5cm左右的小段，每段要有芽，分別接種于6種芽分化培養(yǎng)基上。根據(jù)葉芽莖段在不同培養(yǎng)基上誘導叢生芽情況，篩選出適宜的誘導芽分化培養(yǎng)基和外植體，在溫度22-25％、每日光照14小時、光照強度1800～2000Lx條件下培養(yǎng)誘導不定芽。

1.3 叢生芽根分化的誘導

設(shè)置生根培養(yǎng)基3種。叢生芽長1.0～1.5cm時切取叢生芽，接種在3種誘導根分化的1/2MS培養(yǎng)基上(表2)，每三角瓶培養(yǎng)基上接種3～5個，用膜封口，培養(yǎng)條件同誘導叢生芽條件。

1.4 試管苗的移栽

在三角瓶根分化培養(yǎng)基上已生根的葡萄小植株，揭去瓶口封膜在培養(yǎng)室中煉苗7～10天，莖桿逐漸變紅，葉片油亮并形成保護組織，部分苗梢部伸出瓶口。將此組培小苗取出，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽到滅過菌的蛭石和珍珠巖(1:1)的基質(zhì)中，澆透水，用塑料薄膜蓋好，在膜上打些小孔，利于通氣，置于溫室中，一周后逐漸揭去塑料膜，二周后植株開始長出新葉，根開始伸長且長出新根。將組培苗連同基質(zhì)一起移入盆中或苗圃中。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽誘導效果

腋芽莖段在芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，產(chǎn)生綠色不定芽，再經(jīng)一周時間長成叢生芽，不同培養(yǎng)基的誘導效果見表3。6種芽分化培養(yǎng)基對葡萄腋芽莖段發(fā)生不定芽的誘導率75％～100％，不定芽發(fā)生數(shù)量以D和E兩種芽分化培養(yǎng)基(1/2MS+0.03mg/L NAA+1.0mg/L6-BA和1/2MS+0.05mg/LNAA+1.0mg/L6-BA培養(yǎng)基)誘導出的為多，分別是8個和6個。但不定芽的生長情況以F培養(yǎng)基(1/2MS+0.10 mg/LNAA+1.0mg/L6-BA培養(yǎng)基)較好。

2.2 根的誘導效果

切取的叢生芽接種在根分化培養(yǎng)基上，經(jīng)過10天的培養(yǎng)，在單芽莖段基部產(chǎn)生愈傷組織，隨后分化出了幼根，如表4。S1、S2和S3三種培養(yǎng)基中，以S2根分化培養(yǎng)基(1/2MS+0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基)誘導出根效果最好，誘導率達到100％，平均生根條數(shù)4.7條。S1(1/2MS+0.1 mg/L IAA+0.05 mg/L NAA)和s3(1/2MS+0.05 mg/L NAA)培養(yǎng)基的誘導率分別為64％和71％，平均生根條數(shù)分別為2.5條和3.0條。

2.3 無菌植株的建立

莖段帶菌是建立無菌系的障礙。當葉芽莖段經(jīng)過75％酒精殺菌20秒、0.1％的升汞溶液殺菌8分鐘后，未能徹底解決莖段帶菌問題，接種于培養(yǎng)基第4天，在莖段周圍可見菌落，而遠離莖段的培養(yǎng)基上未見霉菌菌落，污染多發(fā)生在莖段處。接種于培養(yǎng)基第6天，在超凈工作臺上，將未染菌的莖段轉(zhuǎn)移，最終建立了無菌植株。

2.4 試管苗的移栽

葡萄試管苗葉片薄，組織結(jié)構(gòu)疏松，氣孔突起，開口大，根系活力低，是移栽于基質(zhì)中困難的主要原因。光培煉苗改善苗質(zhì)是移栽成活的關(guān)鍵，掌握好移栽過程中的細節(jié)，移栽成活率能達到90％以上。3結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，巨峰葡萄無菌腋芽莖段誘導叢生芽較適宜的培養(yǎng)基組成為1/2MS+0.03～1.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA，腋芽莖段不定芽發(fā)生快，數(shù)量多。較適宜的根分化培養(yǎng)基組成為1/2MS+0.1mg/LIAA，根系發(fā)達，健壯。腋芽莖段組培誘導叢生芽和根的環(huán)境條件是溫度22～25℃、每日光照14小時、光照強度1800～2000Lx。培養(yǎng)建立無菌植株，需對腋芽莖段進行嚴格殺菌消毒。發(fā)現(xiàn)帶菌莖段，及時將未污染的莖段轉(zhuǎn)移。組培苗由三角瓶培養(yǎng)基上移栽于基質(zhì)中前，需經(jīng)光鍛煉健壯后進行。

試驗中發(fā)現(xiàn)0.1％的升汞浸泡8分鐘，時間稍長些，對莖段有一定程度的毒害作用，影響了莖段腋芽萌發(fā)，可以進行減少升汞消毒的時間試驗，減輕對莖段的毒害影響。對不定芽繼代培養(yǎng)中的繁殖系數(shù)，繁殖周期以及誘導生根的周期，移栽到大田后根系的發(fā)育情況等需進一步研究。

通過葡萄葉芽莖段誘導叢生芽的途徑獲得了再生完整小植株，為葡萄苗木的快速繁育提供了可能途徑。