黑龍江漢族速滑運動員優秀耐力能力與肌型肌酸激酶基因（CKMM）A/G多態的關聯研究

周文婷，李麗文，劉向宇

（1.哈爾濱體育學院 運動人體科學系，黑龍江 哈爾濱 150008；2.東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030）

肌酸激酶（CK）是一個與細胞內能量運轉，肌肉收縮，ATP再生有直接關系的重要激酶［1-2］，它可逆地催化肌酸（Cr）與ATP之間的轉磷酰基反應，是該反應的關鍵酶。CK與磷酸肌酸（PCr ）組成肌酸-磷酸肌酸穿梭系統，可作為細胞內“暫時的能量緩沖系統”，用以在高能量需求時維持細胞內的ATP/ADP比率［3］；同時作為能量轉運單位, 該系統亦作用于將能量從產生部位轉運至利用部位。CK有4種同工酶形式，分別為肌肉型（MM）、腦型（BB）、雜化型（MB）和線粒體型（MiMi），其中CKMM主要表達于骨骼肌中，在心肌中也有少量表達。肌肉中CKMM主要集中在M線附近［4］，主要功能是在肌球蛋白頭部生成高濃度的ATP，為肌肉收縮及運動供能。此外，CKMM在肌質網（SR）Ca2+ ATP酶的附近也有表達［5］，作用可能涉及Ca2+的再聚集［6］，進而影響肌肉的工作能力。

人的CKMM基因位于染色體的19q13.2～q13.3區域，長度約有17.5 kb，包含8個外顯子和7個內含子。研究表明，在CKMM基因3′端非編碼區存在可能與耐力有關的CKMM-NcoⅠ多態位點，且該位點在我國北方漢族人群中的分布與歐美人群相比具有非常顯著性差異［7］；在對耐力訓練效果與該位點多態間的關系進行研究后發現，CKMM基因與跑節省化（RE）指標有關, 該位點不同基因型攜帶者對耐力訓練的敏感性具有顯著性差異［8］，而該位點與個體50W負荷時心臟收縮功能對耐力訓練的敏感性亦存在關聯［9］，從而提示該位點可能與我國北方漢族人的耐力訓練效果相關，這對于了解運動訓練中個體差異的產生原因，科學制定個性化訓練方案提供了理論依據。

黑龍江省是冰雪運動大省，各種冰雪項目，尤其是速滑項目在國際上享有盛譽。黑龍江省冰雪項目運動員作為國家隊隊員的主要后備力量，其選材歷來備受矚目，具有優秀的耐力素質的耐力型速滑運動員更是選材的重點。然而，當前CKMM基因NcoⅠ位點多態性的關聯研究后繼乏力，對其適用性尚無更多佐證。故本研究對黑龍江籍漢族優秀耐力型速滑運動員的CKMM-NcoⅠ位點多態分布進行探索，旨在探尋該多態位點分布與速滑運動員優秀耐力素質間的關聯性，為進一步開展群體遺傳學和體育科學研究提供有益的資料。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象

健康大學生120例，其中男性82人，女性38人，所有研究對象均為黑龍江籍漢族，彼此無血緣關系，受試者基本情況見表1。優秀耐力項目速滑運動員25例，其中男性11人，女性14人，均為黑龍江籍漢族，彼此無血緣關系，基本情況見表2。

表1 大學生受試者基本情況

表2 速滑運動員基本情況

1.2 實驗方法

取靜脈血2mL，2%EDTA抗凝，分離白細胞，-20℃保存。采用Promega公司試劑盒提取基因組DNA。PCR-RFLP法解析NcoⅠ位點基因型，PCR擴增引物序列如下：

F:GGGATGCTCAGACTCACAGA；R:AACTTGAATTTAGCCCAACG。

PCR反 應 體系為：PCR反 應 buffer 2μL，1.5mmol/LmgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μmol/L，上、下引物各0.5μmol/L，Taq酶1U，模板100ng，無菌水補足至20μL。

PCR反應參數為：94 ℃預變性7min，94 ℃變性40s，50℃退火40s，72 ℃延伸60s，30個循環，最后72 ℃延伸10min。取5μL擴增產物在2%瓊脂糖中進行電泳，90V 40min檢驗擴增效果。

取PCR擴增產物7 μL、限制性內切酶NcoⅠ1μL（8 U）、10×緩沖液2 μL和0.1% BSA 2 μL于37 ℃酶切8 h。酶切產物以3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統紫外光成像。

1.3 統計分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。以χ2檢驗計算基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。采用r×c列聯表卡方檢驗計算與其他人群的基因型分布差異。檢驗顯著性水平定為P ＜ 0. 05，非常顯著性差異定為P ＜ 0. 01。

2 結果與分析

CKMM基因經PCR及NcoⅠ內切酶消化以后得到3種條帶：有酶切位點的純合型有153 bp /206 bp 兩條帶，沒有酶切位點的純合型只有359 bp 1條帶，而雜合型有153 bp /206 bp + 359 bp 3條帶，其中153 bp + 206 bp /153 bp + 206 bp 是A/A純合型，359 bp/359 bp是G/G純合型，153 bp + 206 bp/359 bp是A/G雜合型。

3種基因型在健康大學生及耐力型速滑運動員中的分布經卡方檢驗符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律( P ＞ 0. 05)，具有群體代表性。不同性別受試者在NcoⅠ位點的基因型和等位基因分布頻率均無顯著性差異，與周多奇等［7］研究結果相似，表明黑龍江籍漢族人在該位點與所涉地域更廣的我國北方漢族人多態分布相近，具有典型的北方漢族群體遺傳特征，具體分布見表3。

表3 黑龍江漢族大學生及耐力型速滑運動員CKMM 基因NcoⅠ位點多態性分布

與加拿大、西班牙和意大利人群相比，包括黑龍江在內的我國北方漢族人及黑龍江耐力型速滑運動員在該位點的等位基因頻率和基因型頻率與他們均有非常顯著性差異（P ＜ 0. 01），而與韓國人相比，基因型頻率和等位基因頻率差異均不顯著。在對其他種族間數據進行比較后發現，韓國人與各歐美人群在等位基因頻率和基因型頻率上均呈顯著性差異（P ＜ 0.05），而歐美各國人群組間則均無顯著性差異（見表4）。

表4 不同種族人群CKMM 基因NcoⅠ位點多態性分布

個體間體質和運動能力的差異受多種因素影響，其中環境（運動訓練、營養與技術方法）和遺傳因素在很大程度上起決定作用。而在相同的環境下，不同的遺傳背景可能是影響個體間不同體質、不同運動能力的主要原因。1998年Montgomery等［16］對血管緊張素轉化酶基因ACE進行的劃時代研究開啟了運動能力相關基因多態研究的新領域。隨著生物技術與分子遺傳學的進一步發展，迄今已有包括214個常染色體基因位點、7個X染色體位點和18個mtDNA序列多態性位點在內的，與人類體質和優秀運動能力有關的基因位點被發現和定位［17］，其中有關耐力素質的研究較多，發現也較集中，極大豐富了人們對不同種族、不同地域人群體質和運動能力差異性原因和機制的認識，也更好地促進了群體遺傳學的發展。作為運動能力的重要組成部分，耐力素質是多基因控制的復雜表型。有人研究了多個代謝基因對耐力運動員體型、慢肌纖維比例及最大氧消耗量的綜合作用，發現了10個與耐力相關的基因多態型，而這些基因多態型在運動員中表達的數量越多，運動員的慢肌纖維比例越高，氧消耗量越大，耐力素質也越好［18］。隨著高通量SNP分析技術的應用，更快更方便的全基因組測序技術的發展，基因間的微小、多重、積累的相互作用將被檢測，“運動基因”的探尋進程有望加快，通過分子技術進行優秀運動員選材的愿望將更快實現［19］。

CKMM基因NcoⅠ多態性是除ACE基因I/D多態性、ACTN3基因rs540874多態性外，已報道的可能與耐力運動能力和耐力訓練敏感性相關的多態位點，其中雜合型A/G攜帶者被認為可能具有更高的耐力水平和更高的訓練敏感性［7，20-21］，周多奇等［7-9］對我國北方漢族人耐力訓練敏感性的研究也對此也予以了證實。然而，CKMM基因NcoⅠ位點多態性的應用性研究后繼乏力，冰雪項目更是從未涉及，故本文首次對冰雪項目運動員的優秀耐力素質與該位點的關聯性進行了探索。結果發現，黑龍江籍漢族人中A/G基因型的頻率為22%，與我國北方漢族人（24%）中該基因型頻率相似，與韓國人（31%）相比差異也不顯著（P＞0.05），但與歐美各國人相比，其分布頻率非常顯著低于各國（35%～54%）（P＜0.01）；而在韓國人中，其分布頻率也顯著低于歐美各國（P＜0.05），歐美各國人間其分布頻率則無顯著性差異（P＞0.05），表明CKMM基因NcoⅠ多態性可能存在種族及地域上的顯著差異，而這或許正是亞洲地區與歐美地區人群間存在較大體質和耐力水平差異的原因之一。此外，研究還發現，黑龍江優秀耐力型速滑運動員中A/G基因型的頻率為32%，略高于包括黑龍江省在內的我國北方漢族人中該基因型的頻率（22%及24%），與韓國人（31%）結果非常相似（P＞0.05），無顯著性差異，表明黑龍江漢族耐力型速滑運動員在CKMM基因NcoⅠ多態位點的分布與優秀耐力素質無關，該位點不能作為其耐力素質選材的遺傳學標記，速滑運動員的優秀耐力素質更多受到其它環境因素（運動訓練、營養與技術方法）的影響。當然，由于實驗設計及研究樣本量所限，很多研究都可能出現結論的相悖，然而隨著后基因組計劃及群體遺傳學的的深入開展，相信大量的遺傳學信息將會逐漸彌補這些缺憾，而本研究也將在未來進一步加大樣本含量，以期更準確地描述該基因多態位點的分布特征。

3 結論

綜上，研究首次對黑龍江漢族耐力型速滑運動員在CKMM基因NcoⅠ位點的多態分布進行了檢測，結果發現，等位基因頻率分別為A=84%和G=16%，基因型頻率分別為A/A=68%、A/G=32%，基因型和等位基因頻率在男性和女性間無顯著性差異（P＞0.05），與歐美人群相比頻率差異具有顯著性（P＜0.05），而與包括黑龍江省在內的我國北方漢族人及韓國人相比差異不顯著（P＜0.05），故該位點不能作為其耐力素質選材的遺傳學標記。雖然如此，研究對我國北方漢族人，尤其對黑龍江漢族優秀運動員在CKMM基因NcoⅠ位點的多態分布信息進一步予以了補充，為后續更加深入的群體遺傳學研究和運動能力的分子生物學研究亦提供了有用的資料。

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