生物傳感分析儀在乳酸發酵中的應用研究

任石茍 李奠礎 許志芳

（1山西輕工職業技術學院，太原030013） （2山西瑞潔生物科技有限公司，侯馬043000）

·應用研究·

生物傳感分析儀在乳酸發酵中的應用研究

任石茍1*李奠礎1許志芳2

（1山西輕工職業技術學院，太原030013） （2山西瑞潔生物科技有限公司，侯馬043000）

簡述了生物傳感分析儀的檢驗原理，對5個發酵液樣品進行了測定，其結果是精密度和測定周期都優于常規分析。

生物傳感儀；乳酸；葡萄糖；固定化酶

乳酸菌發酵的特點是邊糖化、邊發酵，既有淀粉質水解為葡萄糖，又有葡萄糖轉化為乳酸。葡萄糖的變化可衡量發酵正常與否，以消耗葡萄糖值的數量來確定發酵水平的高低，及時準確地測定發酵料中殘還原糖的含量，以便了解發酵過程中糖類消耗情況。利用先進的跟蹤檢測技術在人為條件控制下使耗糖、產酸達到最佳狀態，將有助于指導發酵生產。

目前，國內乳酸發酵生產中測定還原糖一般采用化學分析法，應用較為普遍的有斐林定糖法。斐林定糖法始于20世紀40年代，至今仍常見于我國的工廠和實驗室，是傳統的測糖方法，其實質為二價銅在堿性條件下被還原糖中游離羰基還原為一價的氧化亞銅。因此，堿性斐林氏溶液測定的還原糖類應該包括：麥芽糖、乳糖、雙糖等具有還原性的糖類。該測定方法的適用范圍主要為發酵液中的總糖和殘糖的含量。該法操作繁瑣，也容易受還原物質的干擾影響測定結果。另外，其結果需由經驗數字換算，用標準糖液對照分析，故在分析操作時要嚴格遵循規定的操作方法進行，否則將會引入較大誤差。

生物傳感器是利用酶作為分子識別元件，由于酶具有高選擇性及專一性的特點，使得生物傳感器在樣品分析中不需要對樣品進行復雜的前處理，實現了簡單、快速分析的目的。他是迄今為止能在眾多成分存在時，用酶電極法專一性地、快速、準確地定量得到葡萄糖和乳酸含量的方法之一，該方法已納入國家標準。

1 生物傳感分析儀檢驗原理

SBA-40C型生物傳感分析儀是以固定化酶為關鍵元件，由微電腦控制雙指標智能化儀表。他具有兩支生物探測電極，可以用一份樣品在20 s同時得到兩種物質的定量分析結果，同時自動完成沖洗循環，然后進行下一次的測定。可以由電腦自動定標，以達到精確的定量測定結果。

SBA-40C型生物傳感分析儀是利用酶促反應來定量，其工作原理為：固定化酶針對性地專一催化某一底物生成葡萄糖酸、丙酮酸等產物和過氧化氫。其反應過程為：

其中：固定化酶有谷氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；底物有谷氨酸、葡萄糖、乳酸；產物有（α－酮戊二酸＋NH4）、（丙酮酸+H2O）、（葡萄糖酸+H2O2）。

酶是一種特殊的具有催化活性的蛋白質，他的催化活性隨保存時間的延長或測定樣品次數的增加而逐步降低。但酶經固定化處理后，這一過程會顯著變慢。在固定化酶膜的保存期內，可以近似地把酶的活性看作不變。H2O2電極與固定化酶膜緊貼在一起，酶只在局部位置上起作用。在較短時間內，可以認為緩沖液中樣品和H2O2濃度不變。酶膜上底物濃度Sd是緩沖液中的底物向膜內滲透和酶反應分解的綜合結果。根據菲克擴散第一定律和酶反應米氏動力學公式，當被測物的濃度很低時（S<

其中，Dd為底物通過支撐膜向酶膜層的擴散系數；S為緩沖液中的底物濃度；t為酶反應時間；Vmax為最大反應速度；Km為米氏常數。因開始測定時Sd=0，計算后得到：

另外，電極表面的H2O2的濃度與酶生成H2O2速度和H2O2向緩沖溶液中的擴散速度有關，電極表面H2O2濃度C與酶反應時間t的關系為：

其中，DH為H2O2通過支撐膜向緩沖液的擴散系數。把（1） 式代人（2） 式得到電極表面H2O2濃度C隨時間的變化關系為：

H2O2濃度的變化速率達到最大時，d2C/dt=0，此時H2O2濃度變化速率為：

實驗表明，對同一酶膜，不同濃度樣品達到最大反應速度所需時間t是一致的，所以e-Bt為一常數。在電極表面，H2O2變化的最大速率與被測底物的濃度S成正比。通過測定電極表面H2O2變化的最大速率，并與標準底物作對比，即可計算出被測樣品的濃度。

正是基于這一原理，把固定化酶固定在過氧化氫電極上，反應過程中產生的過氧化氫與葡萄糖或L-乳酸含量成正比，過氧化氫與過氧化氫電極接觸產生電信號，電信號經過放大處理，可直接顯示測定結果。由于產物過氧化氫的量與底物葡萄糖或L-乳酸的量呈線性關系，通過檢測過氧化氫的生成量可得到葡萄糖或L-乳酸的含量。

2 試驗部分

2.1 儀器及試劑

SBA－40C型生物傳感儀：山東省科學院生物研究所；

SBA系列分析儀專用50mg/dL乳酸、100mg/dL谷氨酸－葡萄糖標準液；

SBA系列分析儀專用緩沖劑：每包緩沖劑可配制5000mL緩沖液，使用時，每包緩沖劑加入5000mL蒸餾水，充分搖勻使其完全溶解。

2.2 試驗過程：

2.2.1 采樣

發酵過程中的采樣代表著發酵某個時段及運行期間、發酵液中產酸和耗糖的情況，因此樣品必須具有普遍性，因此在發酵專用取樣口進行取樣時，用蒸汽進行滅菌處理后，將料液自由放出一定量后，用發酵液清洗取樣杯三次，接取相應數量的料液進行檢測。

發酵液樣品編號為：1號樣品（0 h）、2號樣品（12 h）、3號樣品 （24 h）、4號樣品 （36 h）、5號樣品（48 h）、6號樣品（60 h）。

2.2.2 樣品預處理

取經過濾后的樣品1 mL，在容量瓶中用蒸餾水定容至250 mL，使其樣品稀釋到0 mg/100mL～100 mg/100mL范圍內，即為待測樣品。用SBA-40C生物傳感分析儀對發酵液中的乳酸含量及殘糖含量進行測定，緩沖劑為SBA系列分析儀專用緩沖劑。

2.2.3 樣品測定

定標：開機后，把50 mg/dL乳酸、100 mg/dL谷氨酸－葡萄糖標準液注入反應池，進樣量25 μL，20 s后顯示打印數據。反復測定乳酸－葡萄糖標準液，當儀器穩定后，即前后兩針的結果相對誤差小于1%時，儀器便自動定好標，標志是進樣燈（綠燈）一直亮，不閃動。

樣品測定：定標后注入25 μL待測發酵液樣品于反應池中，20 s后顯示打印結果，屏幕顯示乳酸含量及葡萄糖含量。見表1。

表1 樣品檢測打印結果

同時，以斐林氏滴定法進行對比測定。

2.2.4 結果記錄

根據樣品的稀釋情況按以下兩個公式分別計算L－乳酸及殘糖的含量，計算結果見表2。

表2 樣品計算結果

式中：250——稀釋倍數；

1 000——單位換算。

采用斐林氏滴定法對同一樣品殘糖含量進行的測定結果見表3。

表3 裴林氏滴定法測定殘糖含量結果

3 結果討論

3.1 生物傳感儀測定精密度

生物傳感儀測定的殘糖含量結果分析見下頁表4、表5、表6。

3.2 斐林氏測定精密度（見下頁表7）

3.3 測定精密度比較

通過表4～表7分析比較，可以看出應用生物傳感儀分析檢測樣品的精密性較斐林氏滴淀法測定結果要高。

3.4 測定周期

斐林氏檢測方法測糖首先需要按照標準要求進行準確的藥品配制及標定，檢測過程中，除了要進行一定的稀釋外，在滴定過程中還需要加熱煮沸，消耗的時間較為長，操作繁瑣，其結果需由經驗數字換算，用標準糖液對照分析，測定周期約為20 min。采用EDTA絡合滴定法測乳酸含量，也需進行標準溶液的配制與標定。

SBA－40C生物傳感儀可以同時檢測發酵液中L－乳酸和葡萄糖的含量，僅僅需要提前進行設備的預熱和定標，預熱在取樣的同時則可以打開儀器使其自行運行，工作人員取回樣品后即可進行定標，定標20 s可得到結果，再經25 s自動沖洗行下一次測定，3次定標即可進行樣品的檢測，測定周期約為 8 min～10 min。

4 結論

生物傳感分析儀具有測定速度快，測定精度高，每次測定的成本低，操作簡單的特點。對發酵工序中液化程度也可進行檢測。生產實踐中，可根據實際情況對樣品的稀釋度進行調整，從而進一步

的提高生物傳感儀檢測分析的精密度。另外，如何使生物傳感儀實現真正的在線檢測，進而實現乳酸發酵的在線控制，將會成為研究人員感興趣的課題。

表4 1號樣品生物傳感儀測定殘糖含量結果分析

表5 3號樣品生物傳感儀測定殘糖含量結果分析

表6 5號樣品生物傳感儀測定殘糖含量結果分析

表7 斐林氏法測定殘糖含量結果分析

［1］黃潔，宋紀蓉，史紅兵，等.蘋果發酵液中殘余還原糖的測定方法比較［J］.工業微生物，2001，31（3）：38-40.

［2］馮洽平，吳平，羅澤友.生物傳感器用于葡萄酒中葡萄糖含量測定的研究［J］.四川輕化工學院學報，2003，16（1）：56-58.

［3］朱思榮，周萬里，馮東，等.SBA-70型血糖一乳酸自動分析儀的研制［J］.分析儀器，2004（4）：15-19.

Research on the application of biological sensor in lactic acid fermentation

RENShi-gou1*LI Dian-chu1XUZhi-fang2
1（Shanxi vocational and technical college oflight industry,Taiyuan 030013，China）2
（Shanxi ruijie biotechnologycompanyLtd.，Houma 043000，China）

The principle of the biological sensor was introduced.Five lactic acid fermentation samples were detected.The results showed that the accuracyand detection period were better than the normal analysis.

biological sensor； lactic acid；clucose；immobilized enzyme

TS201.1

A

1673-6004（2011）03-0047-05

*任石茍，男，1964年出生，1988年畢業于無錫輕工業學院（現江南大學）工業發酵專業，工程碩士，講師。

2011-09-16