高效液相色譜串聯質譜法分析煙草中15種農藥殘留

嚴會會，胡斌，劉惠民，馬海鳴，王麗杰，石杰*

1.鄭州大學化學系，鄭州高新技術產業開發區科學大道100號450001

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號450001

煙草中農藥殘留量的控制是保證煙草制品吸食安全的重要手段，近年來倍受人們關注。有機磷類農藥具有高效、易降解等特點，其種類繁多，廣泛應用于各種農作物中，在全世界已有70多年的使用歷史[1]。有機磷農藥殘留量的分析方法主要有氣相色譜法(GC)[2-4]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[5-7]和高效液相色譜-質譜法(LCMS/MS)[8-10]。2003年，美國農業部農業研究服務中心的Anastassiades等[11]開發了QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe)方法，用來實現農藥多殘留物的高通量分析。其前處理主要采用乙腈提取，分散固相萃取凈化，操作快速、環保、簡便、價格低廉，主要應用于果蔬和谷物中農藥多殘留物的檢測[12-15]。目前，應用該方法分析煙草中農藥多殘留的報道較少[16]。黃琪等[17]用該方法結合LC-MS/MS分析了煙草中的15種有機磷類農藥的殘留。“吡蚜酮”、“磺吸磷”等15種有機磷類和雜環類農藥的結構和性質差異較大，其在煙草中的殘留分析目前國內尚未見報道。為此，應用QuECh-ERS前處理方法，建立了同時快速分析煙草中“吡蚜酮”、“磺吸磷”等15種有機磷類和雜環類農藥殘留的LC-MS/MS方法，以擴充我國煙草中農藥殘留分析對象的數量，并為批量煙草樣品中多種農藥殘留的快速分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

空白煙葉樣品，即無農藥殘留煙葉樣品，由國際煙草科學研究合作中心(Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco，CORESTA)和英國FAPAS分析實驗室能力驗證(Food Analysis Performance Assessment Scheme)共同提供。

甲醇(色譜純，美國J.T.Baker公司);乙腈(色譜純，美國ROE公司);氯化鈉(AR，天津市恒興化學試劑制造有限公司);無水硫酸鎂(AR，天津凱通化學試劑有限公司)，于600℃馬弗爐中烘烤5 h，儲存于干燥器內備用;PSA吸附劑(primary secondary amine，N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑)(Dikma Technologies)。

農藥標準品分別購自美國Sigma，Chem Service和德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

Agilent 1200高效液相色譜系統(美國安捷倫公司);API4000三重四極桿串聯質譜儀、Analyst1.4.2數據采集處理系統(美國應用生物系統公司);Milli-Q50超純水儀(美國Millipore公司);CP2245電子天平(感量0.0001 g，德國Sartorius公司);Sigma 1-15PK高速離心機(德國Sigma公司);0.45 μm有機相針式過濾器(上海安譜科學儀器有限公司);1.5 mL和50 mL離心管(美國安捷倫公司)。

1.2 樣品處理與分析

準確稱取2.0 g煙末至50 mL離心管中，加入10 mL水靜置10 min，然后加入10 mL乙腈，手持振蕩1 min，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，立即手持振蕩2 min，于4 000 r/min離心10 min。離心后，移取上清液乙腈層1 mL于1.5 mL離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂和25 mg PSA，手持振蕩2 min，于6 000 r/min離心2 min，取上清液200 μL并用流動相稀釋至1 mL，經0.45 μm有機相濾膜過濾后進行LC-MS/MS分析。分析條件為:

色譜條件:Waters Atlantis dC18色譜柱(2.1 mm×150 mm i.d.3 μm，美國Waters公司);柱溫:25℃;流速:0.2 mL/min;進樣量:10 μL;流動相A:水;流動相B:乙腈;流動相洗脫梯度:5%B(體積分數)于1 min內線性升至95%，于9 min內線性降至70%，于2 min內降至5%B并保持6 min;質譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正離子掃描;監測模式:多反應監測(MRM);電噴霧電壓(Ion Spray Voltage，IS):5500 V;霧化氣壓力(GS1，N2):0.413 MPa;輔助加熱氣壓力(GS2，N2):0.345 MPa;駐留時間(Dwell Time):50 ms;離子源溫度(TEM):500℃。15種農藥的質譜檢測條件見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

該方法所檢測的吡蚜酮等15種農藥的極性均較大，易于離子化，適合ESI離子源。選擇Q1全掃描，結果顯示在正離子掃描模式下，所有化合物的響應值明顯優于負離子掃描模式，且具有較高的靈敏度。一般化合物都選擇2個離子對，其中干擾少、響應較高的離子對作為定量離子對，另一離子對作為輔助定性離子對，如表1所示。

表1 15種農藥的質譜檢測條件①

2.2 液相色譜條件的優化

流動相組成是MS/MS響應信號的重要影響因素。為選擇適宜的流動相，考察了甲醇/水體系、乙腈/水體系及不同的流動相洗脫程序。采用乙腈/水體系和甲醇/水體系時分析物的信號強度和出峰情況相似，由于樣品前處理采用乙腈作萃取溶劑，所以選擇乙腈/水體系作為流動相。為提高復雜樣品的色譜分離和質譜鑒定效率，對流動相洗脫梯度進行了優化，最終采用的流動相梯度洗脫程序見1.2，優化后的MRM離子色譜圖見圖1。

圖1 加標水平為1.0 μg/g的空白煙葉樣品的總離子流圖

2.3 提取方法的選擇

QuEChERS法最初是用于蔬菜和水果的前處理，而復烤后的煙葉與蔬菜水果的最大區別是含水率低，復烤后煙葉的含水率在11.2%左右，而新鮮水果和蔬菜的含水率大都在80%左右。所以在操作前，必須補足水分使含水率達到75%以上。比較在加入乙腈提取前，不加水浸潤和分別向2.0 g煙葉樣品中加水2，4，6，8，10，15和20 mL浸潤等8種情況，結果見表2。

表2 不同加水量樣品的回收率(%)

由表2可知，先加水浸潤煙末，農藥更容易游離出來。當對2.0 g煙葉樣品的加水量為8和10 mL時，15種農藥的回收率均在正常范圍內，因此，本實驗采用加水量10 mL。

2.4 基質標準工作曲線與方法的檢出限

為了降低基質效應帶來的離子抑制或增強作用對定量分析產生的影響，采用空白樣品提取液配制一系列基質標準工作溶液進行LC-MS/MS分析，采用外標法定量，即用各農藥所對應的峰面積(y)對其相應濃度(x，ng/mL)進行線性回歸分析，繪制標準曲線(見表3)。

表3 15種農藥的線性方程和檢測限

由表3可知，15種農藥在1～100 ng/mL范圍內線性良好(R2≥0.9991)，檢出限為0.004～0.030 μg/g，可以滿足定量分析的需要。

2.5 方法的回收率與精密度

分別在2.0 g空白煙葉樣品中添加3個水平的15種農藥的混合標準溶液，使各農藥含量分別為0.10，0.25和0.50 μg/g。室溫放置1 h后，按照1.2的前處理步驟進行回收率實驗。每個添加濃度平行重復5次操作，測定精密度，結果見表4。

由表4可知，15種農藥在0.10～0.50 μg/g添加濃度范圍內，加標回收率為70.43%～117.81%，RSD為1.16%～13.89%。方法的準確度和精密度均符合農藥多殘留分析的要求。

2.6 4種煙葉樣品的分析

測定了由FAPAS(Food Analysis Performance Assessment Scheme)所提供的4種煙葉樣品中的15種農藥殘留量。結果表明，4種煙葉樣品中均檢測出“多菌靈”、“吡蚜酮”、“啶蟲脒”、“異惡草酮和噻蟲嗪”等5種農藥，其平均含量分別為0.30，0.0016，0.48，0.11和1.43 μg/g，其余農藥未檢出。檢出的各農藥含量均低于CORESTA(Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco)于2008年發布的指導性殘留限量[18]。

表4 15種農藥在不同濃度下的精密度和回收率

3 結論

采用乙腈提取、PSA吸附劑凈化和LC-MS/MS方法對煙草中的吡蚜酮、磺吸磷等15種有機磷類和雜環類農藥殘留進行了快速檢測分析。15種農藥在0.10～0.50 μg/g添加濃度范圍內，回收率為70.43%～117.81%，RSD為1.16%～13.89%。該方法準確度較高、重復性較好，擴充了我國煙草中農藥多殘留分析的研究對象，適用于批量煙草樣品的快速分析。

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