低溫保存的GFP標記脂肪源性干細胞體外構建組織工程骨的研究

劉廣鵬，孫劍，李宇琳，周恒，崔磊

脂肪源性干細胞（adipose-derived stem cells，ASCs）是存在于脂肪組織中的一類成體干細胞，可以向中胚層多種細胞分化[1-2]。近年來的研究表明，因獲取時對機體損傷小、培養擴增后數量充足、且自體細胞避免了免疫排斥反應等特點，ASCs 已經成為骨組織工程種子細胞的重要來源之一[3]。本實驗室在運用組織工程技術修復大動物骨缺損的研究基礎上，建立了一套完整的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因標記技術，可以直接追蹤 GFP 標記的細胞在體內的分化與轉歸，為組織工程研究提供了一種簡便、靈敏、可靠而又直觀的細胞標記示蹤方法[4]。本實驗則針對低溫保存是否會對 GFP 標記的 ASCs 接種支架材料后的體外生長特性及成骨能力產生影響進行了相關的研究，以期為驗證低溫保存后的 ASCs 作為組織工程骨種子細胞的可行性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 GFP 逆轉錄病毒由本實驗室自行構建[5]；PT67 包裝細胞為美國 Clotech 公司產品；G418 培養液為上海華舜生物工程有限公司產品；DMEM 低糖培養基為美國 Hyclone 公司產品；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；I 型膠原酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、2-磷酸抗壞血酸、Hoechst 33258 熒光染料、二甲基亞砜（DMSO）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒均購自美國 Sigma 公司；骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）含量檢測試劑盒購自美國 Biomedical Technologies 公司。

1.1.2 試驗動物 純種 Beagle 犬 4 只，1 歲齡，雌雄不限，體重 15 ～ 18 kg，上海農學院提供。

1.2 方法

1.2.1 犬 ASCs 的分離和培養 1 歲齡 Beagle犬 4 只，雌雄不限，麻醉后無菌條件下取腹股溝皮下脂肪組織約 15 g。將脂肪組織充分剪碎后，以0.075% 的 I 型膠原酶 37 ℃ 振蕩消化 25 min。1500 × g 離心 10 min，收集沉淀細胞，以 4 ×104/cm2密度接種于直徑 100 mm 細胞培養皿中，加入含 10% 胎牛血清的低糖 DMEM 培養液，37 ℃、5% CO2、100% 濕度條件下常規培養。24 h后首次換液，以后每周換液 2 次。當細胞生長至70% ～ 80% 融合狀態時，以 1:3 的比例消化傳代（0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA）。選用第 2 代（Passage 2，P2）細胞進行以下實驗。

1.2.2 重組 GFP 逆轉錄病毒（GFP-RV）載體制備與細胞轉染 重組 GFP-RV 構建過程見文獻[5]。取生長狀態良好的 PT67 包裝細胞接種到35 mm 細胞培養皿中，加入含 10% 胎牛血清的DMEM 培養液，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養 18 ～ 24 h。待細胞貼壁生長達 70% 融合時，棄去培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞 1 次，滴加含 Lipofectamin（20 μl）和質粒 DNA（4.9 μg）的無血清 DMEM 培養液 1 ml，輕輕混勻，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養 24 h 后更換普通培養液。4 d 后，用含 400 mg/L 的 G418 培養液篩選。抗性克隆初步形成后，觀察其綠色熒光的強度，將抗性克隆移出，繼續用 G418 培養基篩選，擴增至全部形成抗性細胞克隆，以含 20% 胎牛血清的DMEM 培養液培養傳代，收集含重組 GFP-RV 的PT67 細胞上清培養液，以 0.22 μm 無菌濾膜過濾，裝入 50 ml 離心管內，于 4 ℃ 儲存備用。

取生長至 80% 融合狀態的 ASCs，以無血清DMEM 培養液洗滌 1 次，加入上述病毒液約10 ml/培養皿。同時加入 Polybrene（10 mg/L）以增強轉染率。12 h 后改用 10% 胎牛血清的 DMEM培養液培養，待細胞接近完全融合狀態時，加入含300 mg/L 的 G418 培養液篩選并擴增抗性克隆。

1.2.3 ASCs 低溫凍存與復蘇 消化收集 GFP轉染的第 2 代 ASCs，加入 4 ℃ 預冷的凍存液（10% DMSO，40% FBS，50% 低糖 DMEM），調整細胞密度為 1.0 × 107/ml，轉移到 2.0 ml 細胞凍存管中，4 ℃ 放置 30 min，–20 ℃ 放置 2 h，–70 ℃ 放置 24 h，然后轉入液氮罐內。細胞在–196 ℃ 液氮中保存 4 周后取出，置入 37 ℃ 水浴箱，快速復蘇，臺盼藍染色計算復蘇細胞的存活率，并按下式計算復蘇細胞的存活率：細胞存活率 = 臺盼藍拒染（透明）的細胞數/總細胞數 ×100%。

復蘇細胞經 PBS 洗滌 3 次，去除凍存液成分，按 0.5 × 106/皿的密度接種培養皿，培養至 80% ～90% 融合時，消化收集細胞接種脫鈣骨材料。

1.2.4 細胞接種 DBM 材料 選擇孔隙率較為均勻的豬股骨來源的部分脫鈣骨基質（本實驗室制備），制成 5 mm × 5 mm × 5 mm 的立方體備用。消化收集細胞，調整密度為 1.0 × 106/ml，均勻地接種在 DBM 上，每塊材料接種 40 μl 細胞懸液。培養箱內靜置 4 h 后，加入成骨誘導培養液繼續培養，每周換液 2 次。成骨誘導培養液成分為：低糖 DMEM 基礎培養液，10% 胎牛血清，10 nmol地塞米松，10 mmol β-甘油磷酸鈉，50 μmol 2-磷酸抗壞血酸。對照組為未經低溫凍存復蘇的 P2 代細胞。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察 ASCs 接種DBM 材料后每天在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞在材料上的生長情況，連續 1 周。GFP 激發波長488 nm，發射波長 530 nm。

1.2.6 細胞在材料上的增殖與成骨檢測 實驗組與對照組的細胞材料復合物置于 24 孔培養板中成骨誘導培養，每隔 48 h 兩組各取 4 份細胞材料復合物測定 DNA 含量（Hoechst 33258 熒光比色法）[3]，根據標準曲線換算為細胞數量，觀察細胞在材料上的增殖情況。同時采用磷酸對硝基苯酯二鈉鹽（p-nitrophenylphosphate disodium salt，PNP）比色法測定細胞內 ALP 的活性，并以 OCN 試劑盒檢測細胞產生 OCN 的含量，實驗方法參照試劑盒操作程序。

1.3 統計學分析

采用 SPSS10.01 統計軟件包進行分析。每組共計 4 例樣本，各檢測時間點每組每例取4 孔細胞，重復 3 次。DNA 細胞數量、ALP 活性和 OCN含量的數據以±s 表示，組間比較采用配對t 檢驗，P ＜ 0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復蘇細胞存活率

復蘇細胞存活率為（91.42 ± 1.87）%（n = 4），表明低溫凍存方法對犬 ASCs 的細胞活性無顯著影響。

2.2 細胞材料復合物的激光共聚焦顯微鏡觀察

低溫保存復蘇后的 ASCs 在 DBM 上呈多層排列，隨培養時間延長分泌大量的細胞外基質，細胞融合成片，發出綠色熒光（圖 1）。

2.3 細胞增殖檢測

DNA 含量檢測顯示低溫保存前后的 ASCs在 DBM 材料上增殖良好，12 d 后細胞數量達到峰值。實驗組與對照組細胞的增殖趨勢基本一致，表明低溫保存對細胞的增殖活性無明顯影響（圖 2）。

圖 1 低溫保存復蘇后的 ASCs 在 DBM 上隨培養時間延長數量逐漸增多，細胞融合成片，發出綠色熒光（A：3 d；B：7 d）Figure 1 The laser confocal microscopy observation showed that the cryopreserved, GFP-labeled ASCs proliferated well on the DBM scaffold with time, excreting large amounts of extracellular matrix (A: 3 d; B: 7 d).

圖 2 低溫保存前后的 ASCs 的細胞生長曲線。細胞數量逐漸增加，第 12 天達到最高峰，隨后保持在相對較高的水平。兩組在各時間點比較，差異無顯著性（n = 4，P ＞ 0.05）Figure 2 The growth curves of the cryopreseved and non-preserved ASCs. Cell numbers from both groups increased steadily, and reached the plateau at day 12. No significant difference could be found at each time point checked (n = 4,P ＞ 0.05).

2.4 ALP 活性測定

低溫保存前后的 ASCs 在 DBM 上的 ALP表達活性均隨培養時間延長而不斷增加，分別從第1 天的 0.962 U/萬細胞和 1.118 U/萬細胞上升到培養 14 d 時的最高值 7.684 U/萬細胞和 7.916 U/萬細胞。兩組細胞 ALP 活性的變化是平行的，在各檢測時間點無顯著性差異（圖 3）。

2.5 OCN 含量測定

圖 3 低溫保存前后的 ASCs 隨誘導時間的延長 ALP 活性遞增（n = 4，P ＞ 0.05)Figure 3 The measurement of ALP activity of the cryopreserved and non-preserved ASCs showed the steady increase in both groups (n = 4, P ＞ 0.05).

圖 4 低溫保存前后的 ASCs 經成骨誘導 12 d 后，OCN含量出現明顯上升，兩組的檢測無明顯差異（n = 4，P ＞ 0.05）Figure 4 After 12 days of osteogenic induction, the OCN content was dramatically increased in the cryopreserved and non-preserved ASCs. No difference of the OCN content was found between these two groups (n = 4, P ＞ 0.05).

實驗組與對照組的細胞材料復合物分泌 OCN的量在前 12 天基本保持在比較恒定的水平，第12 天后進入較快增長期，兩者的比較無明顯差異，表明低溫保存對細胞在 DBM 上合成分泌 OCN無明顯影響（圖 4）。

3 討論

如何獲得足量的種子細胞，解決種子細胞體外大規模擴增、凍存及建立細胞庫等問題一直是組織工程研究的重要內容[6]。ASCs 來源于機體的脂肪組織，是繼骨髓基質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）后在干細胞領域展開廣泛研究的一類成體干細胞。ASCs 不僅與BM-MSCs 具有相似的干細胞表面標志，也具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉和神經等細胞分化的能力[1-2]。由于脂肪組織常被視為“多余”組織，且分布廣泛，來源充足；并且抽吸脂肪組織對患者無額外創傷，患者易于接受，無心理顧慮。因此，ASCs 作為組織工程新的種子細胞來源，其應用具有良好的前景。

組織工程產品的保存是包括組織工程骨在內所有組織工程化組織產業化發展所面臨的重要問題。隨著細胞低溫保存技術的發展，目前已可在體外長期保存多種細胞，例如胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞及各種終末分化細胞等[6]。低溫保存技術將有可能成為組織工程種子細胞的常規保存方法，從而真正解決種子細胞體外擴增時間長與臨床患者無法長時間等待之間的矛盾。

但是，對于組織工程化組織和器官的構建，細胞在生物材料上的增殖、分化及合成分泌細胞外基質的功能對最終能否在體內形成相應的組織或器官并發揮其功能起著十分重要的作用。低溫保存是否會影響 ASCs 在三維支架材料上的增殖、合成與分泌基質及組織工程骨的形成，相關的研究較少。故本實驗對低溫保存是否會影響 ASCs 在 DBM上的體外增殖及成骨潛能進行了研究。

GFP 是一種比較成熟的熒光蛋白，已廣泛應用于細胞標記示蹤[7]。本實驗采用逆轉錄病毒轉染法使編碼 GFP 的基因序列整合到靶細胞染色體中，GFP 蛋白能夠隨細胞生長而穩定表達，從而為骨組織工程種子細胞標記提供了一種快速、簡便、靈敏、可靠而直觀的方法。本實驗采用 GFP 標記技術觀察到低溫保存后的 ASCs 在 DBM 上生長良好，增殖旺盛，證實低溫凍存不影響 ASCs 的 GFP 表達和在 DBM 上的增殖能力。

ASCs 成骨誘導分化為成骨細胞是構建組織工程骨的前提條件。ALP 是成骨過程中分泌的特異性蛋白質，其活性的高表達是成骨細胞早期分化的特異性標志[8]。OCN 與骨基質的羥基磷灰石有較高的親和力，是成骨分化的終末期標志之一[9]。因此，本實驗分別測定了 ALP 活性及 OCN 含量的表達分泌情況，以觀察低溫保存的 ASCs 在 DBM上的成骨分化能力。結果發現低溫保存前后的ASCs 在 DBM 上的 ALP 活性與 OCN 表達量在測定期內不斷增長，顯示低溫保存不影響 ASCs在 DBM 上的成骨分化。

綜上所述，本實驗證實低溫保存不影響犬ASCs 穩定表達 GFP，對細胞在三維支架材料上的體外增殖及成骨能力也無明顯影響，為驗證低溫保存后的 ASCs 作為組織工程骨種子細胞的可行性提供了實驗依據。

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