大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的體外敏感性研究

華 彬 ，魏潤新 ，馬 瑩 ，喬 婧

(1.江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300; 2.南通醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226021)

大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的體外敏感性研究

華 彬1，魏潤新1，馬 瑩1，喬 婧2

(1.江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300; 2.南通醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226021)

目的利用噻唑藍(lán)(MTT)比色法探討大腸癌細(xì)胞對(duì)腫瘤化療藥物的體外敏感性。方法對(duì)36例患者的大腸癌組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用MTT法測(cè)定6種臨床常用化療藥物的抑制率。結(jié)果36例大腸癌試驗(yàn)中，化療藥物的敏感性從高到低依次為絲裂霉素(MMC)、順鉑(DDP)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、依托泊苷(VP－16)、奧沙利鉑(L－OHB)、阿霉素(ADM)。其中18例結(jié)腸癌試驗(yàn)中，化療藥物的敏感性從高到低依次為 MMC，DDP，5－FU，VP－16，L－OHB，ADM;18例直腸癌試驗(yàn)中，化療藥物的敏感性從高到低依次為 MMC，DDP，5－FU，L－OHB，VP－16，ADM。結(jié)論對(duì)于大腸癌，MMC，DDP，5－FU的敏感性較高，可作為首選藥物;對(duì)于結(jié)腸癌和直腸癌，也有相似的規(guī)律性。

噻唑藍(lán)比色法;大腸癌;化學(xué)治療;藥物敏感性

大腸癌(包括直腸癌和結(jié)腸癌)在我國的發(fā)病率逐年上升，危害嚴(yán)重。對(duì)大腸癌要盡可能采取手術(shù)切除，術(shù)后有效的化療有助于提高總體療效[1]。研究表明，鉑類、蒽環(huán)類、氟尿嘧啶類、絲裂霉素的療效較為突出[2]。化療前對(duì)腫瘤患者進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，預(yù)測(cè)化療藥物是否敏感，既能提高化療效果，又能減少非敏感性化療藥物帶來的毒性反應(yīng)。噻唑藍(lán)(MTT)比色分析法是用于檢測(cè)細(xì)胞活性的一種方法，操作簡便、快捷，僅需3 d就能獲得滿意結(jié)果，能充分反映各種化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷或抑制增殖作用，因而改變了靠臨床經(jīng)驗(yàn)選擇化療藥物及化療方案的傳統(tǒng)治療模式，使腫瘤的化學(xué)治療有的放矢，減少盲目性和耐藥性的發(fā)生，具有極其重要的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 藥物和材料

絲裂霉素注射液(MMC，批號(hào)為100109)、阿霉素注射液(ADM，批號(hào)為081003A，為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品)、順鉑注射液(DDP，齊魯制藥有限公司，批號(hào)為9010032DB);5－氟尿嘧啶(5－FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)為100111);依托泊苷注射液(VP－16，批號(hào)為10030613)、奧沙利鉑注射液(L－DHB，為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為09123012)均以無菌生理鹽水稀釋，MMC 稀釋至 100 μg/mL，DDP稀釋至 1 g/L，5－FU 稀釋至 1 mg/mL，VP－16稀釋至 1 g/L，L－OHB 稀釋至142 μg/mL，ADM稀釋至100 μg/mL，置－20℃冰箱中保存。完全RPMI－1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司，含10%小牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL;MTT購自美國Sigma公司，使用前用滅菌生理鹽水配成5 g/L的工作液。大腸癌組織取自本院手術(shù)新鮮標(biāo)本，在無菌條件下送到實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 大腸癌細(xì)胞制備

取切除的大腸癌腫瘤組織，在無菌條件下切取約1 cm3，放入無菌生理鹽水中，快速送到實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)上，用D－Hanks液清洗，用營養(yǎng)液浸泡3 min，去除脂肪、纖維及壞死和血污組織，將剩下的組織用生理鹽水洗凈，在加有少許RPMI－1640營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中剪碎，置200目不銹鋼網(wǎng)篩中過濾，用10 mL注射器芯管研磨，不斷加RPMI－1640營養(yǎng)液沖洗，收集濾液，離心(2 000 r/min)處理10 min，去除上層清液，將沉淀物沖洗兩次，加RPMI－1640營養(yǎng)液攪勻，形成細(xì)胞懸液。

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn)

將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，設(shè)空白組、試驗(yàn)組、對(duì)照組?？瞻捉M用營養(yǎng)液和化療藥物;試驗(yàn)組用腫瘤細(xì)胞懸液和化療藥液，每藥4個(gè)孔;對(duì)照組用腫瘤細(xì)胞和營養(yǎng)液，不加化療藥物。將96孔板置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出后每孔加5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，每孔加 100 μL 的溶解液繼續(xù)培養(yǎng) 16 h，然后將培養(yǎng)板放入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，測(cè)定吸光度(A)值(OD570)。

1.2.3 結(jié)果判斷方法

抑制率(IR)=[1－(腫瘤細(xì)胞對(duì)照組－空白對(duì)照組)/(加藥腫瘤細(xì)胞組－空白對(duì)照組)]×100%。抑制率大于30%為敏感，不超過 30%為不敏感。抑制率比較采用單因素方差分析(oneway ANOVE)，統(tǒng)計(jì)化療藥物對(duì)癌細(xì)胞的抑制率并比較，用SPSS17.0軟件，P＜0.05為差異有顯著性。藥物敏感率=試驗(yàn)中IR＞30%的病例數(shù)/試驗(yàn)總病例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

結(jié)果見表1，平均抑制率由大到小的化療藥物依次是MMC，DDP，5－FU，VP－16，L－OHB 和 ADM。用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析 P=0.000，表明6種化療藥物對(duì)大腸癌細(xì)胞的平均抑制率有顯著性差異。經(jīng)LSD分析，各化療藥物之間比較的 P值見表2。

表1 化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外平均抑制率(%)

可見，MMC對(duì)大腸癌細(xì)胞的體外平均抑制率明顯高于5－FU，VP－16，L－OHB，ADM;DDP的體外平均抑制率明顯高于VP－16，L－OHB和ADM，其他藥物間無明顯差異，且敏感率也較高(見表3)。

表2 化療藥物對(duì)大腸癌細(xì)胞的體外平均抑制率統(tǒng)計(jì)學(xué)方析(P值)

表3 化療藥物的敏感率

2.2 結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

結(jié)果見表1，平均抑制率由大到小的化療藥物依次是MMC，DDP，5－FU，VP－16，L－OHB 和 ADM。用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析 P=0.001，表明6種化療藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的平均抑制率有顯著性差異。經(jīng)LSD分析，各化療藥物之間比較的 P值見表4?？梢姡隗w外培養(yǎng)試驗(yàn)中，MMC和DDP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的體外平均抑制率明顯高于VP－16，L－OHB，ADM;而5－FU的體外平均抑制率明顯高于ADM;其他藥物間無明顯差異。MMC，DDP，5－FU的藥物敏感率較高(表3)。

表4 化療藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的體外平均抑制率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P值)

2.3 直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

結(jié)果見表1，平均抑制率由大到小的化療藥物依次是MMC，DDP，5－FU，L－OHP，VP－16，ADM。用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析 P=0.379，P＞0.05，雖然無顯著性差異，但仍有一定的意義。各化療藥物之間比較的 P值見表5。就表1而言，MMC，DDP，5－FU的體外平均抑制率較其他3種化學(xué)藥物高，且敏感率也較高(表3)，結(jié)果與大腸癌細(xì)胞相似。

表5 化療藥物對(duì)直腸癌細(xì)胞的體外平均抑制率比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P值)

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，6種臨床常用的大腸癌化療藥物對(duì)體外培養(yǎng)的大腸癌細(xì)胞均有較高的平均抑制率，且結(jié)腸癌、直腸癌有著相似的規(guī)律;其中，MMC，DDP，5－FU的抑制率更高一些。由于MTT法陰性符合率為100%，體外耐藥而臨床治療有效率為0，證明體外藥物敏感性試驗(yàn)“假耐藥”的可能性極小，故臨床可根據(jù)耐藥結(jié)果，不再使用無效的化療藥物，避免了不必要的藥品浪費(fèi)，使臨床用藥合理化[3]。對(duì)于體外敏感的藥物，由于MTT法存在一些缺點(diǎn)，如標(biāo)本的純化程度、細(xì)胞懸液中的少許纖維細(xì)胞及血細(xì)胞、藥物與細(xì)胞作用的時(shí)間以及二甲基亞砜的穩(wěn)定性等，結(jié)果會(huì)受到一定影響，會(huì)出現(xiàn)一定數(shù)量的假陽性結(jié)果，因此若能對(duì)每例患者同時(shí)進(jìn)行耐藥基因測(cè)定，則更能提供可靠的化療用藥依據(jù)[4]。

因標(biāo)本為大腸癌組織，考慮到大腸癌組織為糞便污染，取材后標(biāo)本應(yīng)浸泡在含高濃度抗生素液中，去污時(shí)應(yīng)多次洗滌，以去除雜菌，標(biāo)本應(yīng)盡快處理，放置越久活力越低。另外，細(xì)胞懸液應(yīng)盡量混勻，以免影響活細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而影響結(jié)果。筆者是根據(jù)臨床大腸癌用得比較多且較敏感的6種藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)，表5中直腸癌的6種化療藥物體外平均抑制率比較無顯著性差異，不能說明實(shí)驗(yàn)無意義，今后還要不斷完善實(shí)驗(yàn)方法，為臨床提供可靠的藥敏結(jié)果，更好地為臨床服務(wù)。

[1]周際昌.實(shí)用腫瘤內(nèi)科學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:482.

[2]劉德傳，郭以河.MTT法測(cè)定大腸癌對(duì)化療藥物敏感性的試驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(4):699 －701.

[3]徐建明，宋三建，湯仲明，等.MTT體外藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)下的乳癌預(yù)見性化療[J].中華腫瘤雜志，1997，19(2):153.

[4]周海茵，葉古祥，孫國娣.MTT法測(cè)定大腸癌化療藥物敏感性[J].現(xiàn)代診斷與治療，2002，13(1):9－11.

Study on Detecting Sensitivity of Colorectal Cancer Cells to Chemotherapeutic Drugs in Vitro by MTT Assay

Hua Bing1，Wei Runxin1，Ma Ying1， Qiao Jing2
(1.Taizhou People's Hospital，Taizhou，Jiangsu，China 225300; 2.Nantong Medical College， Nantong，Jiangsu， China 226021)

ObjectiveTo study the in vitro sensitivity of colorectal cancer cells to chemotherapeutic drugs by MTT assay.Methods The colorectal cancer tissues from 36 cases were cultured in vitro.The inhibition rate to cancer cells for selected 6 kinds of commonly used chemotherapeutic drugs in clinic were determined by MTT assay.Results In 36 cases of colorectal cancer，the sensitivity of those 6 drugs from high to low was MMC，DDP，5 －FU，VP －16，L －OHB and ADM.Among 18 cases of colonic cancer，the sensitivity sequence of those 6 drugs from high to low was MMC，DDP，5 －FU，VP －16，L － OHB and ADM.Among 18 cases of rectal cancer，the sensitivity sequence of those 6 drugs from high to low was MMC，DDP，5－FU，L－OHB， VP－16 and ADM.Conclusion MMC，DDP and 5－Fu have highly sensitive to colorectal cancer，which can be used as the first choice of drugs.Colonic and rectal cancers have the similar regularity in sensitivity of chemotherapeutic drugs.

MTT assay;colorectal cancer;chemotherapy;drug sensitivity

R965;R979.1

A

1006－4931(2011)10－0023－03

華彬，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作，(電話)0523 －86361360(電子信箱)huayaoshi@sina.com.cn。

2010－08－01;

2011－01－05)