硫酸卡那霉素注射液中有關物質測定方法研究

李玉林，陳真文，周 玲，毛先兵，冉隆富

(西南藥業股份有限公司，重慶 400038)

硫酸卡那霉素注射液中有關物質測定方法研究

李玉林，陳真文，周 玲，毛先兵，冉隆富

(西南藥業股份有限公司，重慶 400038)

目的采用高效液相色譜－蒸發光散射檢測器(HPLC－ELSD)法測定硫酸卡那霉素注射液中有關物質。方法采用Zorbax SB－C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以 0.2 mol/L 三氟醋酸溶液 －甲醇(95 ∶5)為流動相，流速為 1.0 mL/min，柱溫為室溫，用蒸發光散射檢測器檢測(漂移管溫度為80℃，載氣壓力為1.0 bar)。結果以對照溶液質量濃度的對數值與相應峰面積的對數值計算回歸方程，其相關系數(r)均大于0.999，二者線性關系良好。結論高效液相色譜－蒸發光散射檢測器法簡便、準確、專屬、靈敏。

高效液相色譜－蒸發光散射檢測器法;卡那霉素;有關物質;硫酸卡那霉素注射液

硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)是一種氨基苷類抗生素，又名卡那霉素A，主要與細菌核糖體30S亞單位結合，抑制細菌蛋白質合成。對于氨基苷類抗生素卡那霉素、阿奇霉素和鏈霉素等末端紫外吸收的品種[1]，難以選用紫外檢測器檢測，在第29版《美國藥典》中含量測定采用電化學檢測器[2]，而電化學檢測器在國內尚不普及，在2010年版《中國藥典》中上述品種的組分及含量測定采用通用型蒸發光散射檢測器[3]。但兩國藥典僅涉及硫酸卡那霉素注射液的卡那霉素B含量控制，未涉及一般有關物質的檢測。為了保證用藥安全，有必要建立一種新方法，既可檢測卡那霉素B，又能檢測一般有關物質。本試驗用高效液相色譜－蒸發光散射檢測器(HPLC－ELSD)測定硫酸卡那霉素注射液中的有關物質，包括卡那霉素B和一般有關物質。方法學考察表明，該法簡便、準確、專屬、靈敏，可用于硫酸卡那霉素注射液有關物質的控制。

1 儀器與試藥

LC－10AD型高效液相色譜儀(島津);SEDEX55型蒸發光散射檢測器(法國)。硫酸卡那霉素對照品(批號為130556－200501，中國生物制品檢定所);硫酸卡那霉素B對照品(批號為130548－200501，中國藥品生物制品檢定所);硫酸卡那霉素注射液(西南藥業股份有限公司，批號為20090301，20090302，20090303，規格為2 mL∶0.5 g，處方包括主藥硫酸卡那霉素和輔料亞硫酸氫鈉);甲醇(色譜純)，其他試劑(分析純)，水(重蒸餾水)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Zorbax SB －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.2 mol/L三氟醋酸溶液 －甲醇(95∶5);流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;進樣量:20 μL;蒸發光散射檢測器:漂移管溫度80～95℃，載氣壓力 1.0 bar。

2.2 檢測方法

分別稱取卡那霉素對照品和卡那霉素B對照品適量，用水溶解并制成每1 mL約含二者各80 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色譜儀，卡那霉素峰與卡那霉素B峰的分離度大于5.0;5次進樣卡那霉素和卡那霉素B峰面積的相對標準偏差不超過2.0%。取本品適量，用水溶解并定量稀釋成2 g/L的溶液，作為供試品溶液;精密稱取卡那霉素對照品適量，用水定量稀釋制成10，20，50 μg/mL 的溶液，作為對照溶液 A，B，C。分別精密量取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，以對照溶液質量濃度的對數值與相應峰面積的對數值計算回歸方程，相關系數(r)應不小于 0.99。

2.3 方法學考察

流速選擇及系統適用性試驗:分別稱取卡那霉素對照品與卡那霉素B對照品適量，用水溶解并稀釋制成每1 mL約含二者各80 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色譜儀，以1.0 mL/min的流速運行，記錄色譜圖。連續進樣5針，有關物質峰與卡那霉素峰的分離度均大于5，卡那霉素的 RSD為1.2%，卡那霉素B的 RSD為1.6%，表明卡那霉素與其有關物質分離良好，系統適用性試驗的各項指標符合規定，因此將本品流速定為1.0 mL/min。

耐用性試驗:取批號為20090301的樣品，分別在流動相比例為含甲醇 2.0%和 8.0%，酸度分別為 2.0和 2.4，流速分別為 0.8和1.2 min/mL的條件下，觀察色譜條件對系統適應性的影響。結果表明，色譜條件的微小變動對系統適用性影響不大。

專屬性試驗:考慮到多種因素可能導致本品主藥硫酸卡那霉素降解產生有關物質，故在強光、酸、堿、氧化和高溫條件下對樣品做破壞試驗，使之產生有關物質，以考察本檢測方法的有效性;另取硫酸卡那霉素注射液輔料制備空白溶液，同法操作。取樣品，依次進行強光破壞(取本品0.4 mL，在4 500 lx±500 lx光照強度下照射12 h)、酸破壞(取本品0.4 mL，加5 mol/L鹽酸溶液1 mL，于80℃水浴中放置2 h，隨后加5 mol/L氫氧化鈉0.4 mL對酸進行中和)、堿破壞(取本品 0.4 mL，加 5 mol/L 氫氧化鈉 0.4 mL，于 80 ℃水浴中放置2 h，隨后加5 mol/L鹽酸溶液0.4 mL對堿進行中和)、高溫破壞(取本品0.4 mL，于120℃下放置2 h)、氧化破壞(取本品0.4 mL，加 30%H2O2溶液 0.4 mL，于 80 ℃水浴中放置 2 h)試驗。結果見圖1。可見，本品在酸、堿破壞條件下，均會產生擬訂的色譜條件下能夠檢測到的降解產物，而高溫、氧化和強光沒有新的雜質產生，說明本品的光、熱、抗氧性良好;各降解產物峰與硫酸卡那霉素峰分離良好，不影響本品有關物質及硫酸卡那霉素含量的測定。另外，樣品、輔料和原料經酸、堿破壞后峰5都增大，這是由酸和堿中和后生成NaCl造成的;樣品和原料經酸破壞后峰3都增大，說明強酸破壞會生成更多的一般有關物質。

圖1 專屬性考察圖譜

輔料干擾試驗:本品中的輔料為亞硫酸鈉，在上述色譜條件下，SO32－和 SO42－峰重合。從圖 1 也可看出，Na+峰、SO42－峰與主藥分離良好，故輔料不影響主藥含量的測定。

線性關系考察:精密稱取硫酸卡那霉素對照品適量，加水定量稀釋制成 9.2，24，48 μg/mL 的溶液，作為對照溶液 A，B，C。再精密量取各對照溶液20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積。以對照溶液質量濃度的對數值與相應峰面積的對數值計算回歸方程，相關系數(r)均大于 0.99，表明本品質量濃度在 9.2 ～48 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定:取批號為20090301的樣品適量(有關物質的量為1.43%)，分別用水溶解并定量稀釋成每1 mL含有關物質 17.875，8.94，4.47 μg 的溶液，各取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由圖譜分析可知，有關物質質量濃度為8.94 μg/mL時，其信噪比(S/N)為10;質量濃度為 4.47 μg/mL時，其信噪比(S/N)為 3。故本品有關物質的檢測限為 4.47 μg/mL，定量限為8.94 μg/mL。

重復性試驗:取批號為20090301的樣品適量，用水溶解并定量稀釋成2 g/L的溶液，取20 μL注入液相色譜儀，連續6次。結果一般有關物質的 RSD為 1.9(n=6)，卡那霉素 B的 RSD為1.3(n=6)。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12 h時測定其有關物質。結果硫酸卡那霉素一般有關物質的 RSD為1.4，卡那霉素B的 RSD為1.8(n=4)，表明供試品溶液在12 h內是穩定的。

2.4 樣品測定

分別精密量取3個批號的供試品溶液，測其有關物質含量。結果見表1。

表1 樣品中有關物質含量測定結果(%)

3 討論

溫度是影響蒸發光散射檢測器靈敏度的重要因素。試驗中設置了如下幾種不同條件:溫度50℃，載氣壓力1.0 bar;溫度80℃，載氣壓力 1.0 bar;溫度 95℃，載氣壓力 1.0 bar。取 2.2項下的供試品溶液20 μL，在上述設定的條件下進樣，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。比較3種條件下的色譜圖，卡那霉素B及其他有關物質個數相等;但50℃，80℃，95℃時有關物質信噪比分別為24，42，46，故溫度為80℃和95℃的信噪比比較接近且檢測靈敏度高，因此檢測溫度確定為80～95℃。

對于檢測用氮氣，SEDEX55型蒸發光散射檢測器可控制其壓力而不能改變其流量，因此對載氣壓力做了研究。在流速1.0 mL/min和漂移管溫度 80℃條件下，比較了 3種載氣壓力(0.5，1.0，1.5 bar)，結果卡那霉素B和其他有關物質的保留時間基本一致;0.5 bar和 1.0 bar的信噪比一致，1.5 bar的有關物質信噪比比前兩者小，因此確定檢測壓力為1.0 bar。

蒸發光散射檢測器是近年來新發展的通用型質量型檢測器，由于其響應值不依賴被測物質的光學性質，任何揮發性低于流動相的樣品特別是不含共軛結構或無特征紫外吸收的物質用它檢測均有極大的優越性。近年來已有利用蒸發光散射檢測器來分析氨基糖苷類抗生素含量及有關物質的報道[4－5]，2010年版《中國藥典(二部)》硫酸卡那霉素注射液項下沒有設定有關物質檢測項，為確保藥品的安全性以及更好地控制產品質量，參考2010年版《中國藥典(二部)》硫酸卡那霉素含量測定方法和硫酸妥布霉素有關物質[1]測定方法建立了本品的有關物質檢查方法。方法學考察表明，該法簡便、準確、專屬、靈敏。

[1]陳建琴.蒸發光散射檢測器在氨基糖苷類抗生素中的應用進展[J].中國藥業，2008，17(14):78 －80.

[2]The United States Pharmacopeial Convention.USP29[M].USA，2005:1 212.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社，2010:967－999.

[4]張建革，劉 英，王立萍.HPLC－ELSD測定硫酸慶大霉素注射液含量及其有關物質的研究[J].華西藥學雜志，2010(1):80－82.

[5]戴向東，李慧義，張啟明，等.HPLC—ELSD法測定硫酸新霉素的含量及有關物質新霉胺[J].藥物分析雜志，2007，27(2):212－215.

Determination of Related Substances in Kanamycin Sulfate Injection by HPLC－ELSD

Li Yulin，Chen Zhenwen，Zhou Ling，Mao Xianbing，Ran Longfu
(Southwest Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chongqing， China 400038)

ObjectiveTo establish a HPLC－ELSD method for the determination of the related substances in Kanamycin Sulfate Injection.Methods The HPLC system consisted of the C18chromatographic column(250 mm × 4.6 mm，5 μm)and the mixture of 0.2 mol/L trifluoroacetic acetic acid － methanol(95 ∶5)as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was the room temperature.The evaporative light scattering detector(ELSD)with the drift tube temperature of 80 ℃ and carrier gas pressure of 1.0 bar was adopted for detection.Results The regression equation was calculated by the logarithm values of reference solution concentration and the corresponding peak area，the correlation coefficients(r)all were greater than 0.999，showing the good linear relationship between them.Conclusion This method is simple and accurate with good specificity and high sensitivity.

HPLC－ELSD;kanamycin;related substances;kanamycin sulfate injection

R927.11;R978.1+2

A

1006－4931(2011)10－0041－03

李玉林(1974－)，女，醫學碩士，執業藥師，主管藥師，主要從事藥物制劑研究，(電話)023－89855237(電子信箱)li_y_l@163.com。

2010－09－06)