貴陽地區幽門螺桿菌臨床分離株中ureA、cagA、vacA、iceA基因的分布及分析＊

王 菲，康沛萍，吳曉娟，陳崢宏

貴陽地區幽門螺桿菌臨床分離株中ureA、cagA、vacA、iceA基因的分布及分析＊

王 菲，康沛萍，吳曉娟，陳崢宏

目的了解貴陽地區臨床分離的幽門螺桿菌（Hp）的毒力基因ureA、cag A、vac A、iceA的分布特征，探討不同毒力基因型與上消化道疾病的關系。方法用特異的16S rDNA聚合酶鏈反應進行臨床分離Hp的菌種鑒定，對經過鑒定的152株幽門螺桿菌進行ureA、cag A、vac A、iceA基因及亞型的PCR檢測。結果ureA基因的檢出率為100%（152／152），vac A基因的檢出率為100%（152／152），vac A 基因亞型以s1a－m2型為主，占76．3%（116／152），cag A 基因檢出率為39．5%（60／152），ieeA1基因檢出率36．8% （56／152），iceA2基因檢出率為34．2%（52／152），13．2%（20／152）的菌株iceA1和iceA2基因均陽性，不同基因型菌株在慢性胃炎和消化性潰瘍中的檢出率無統計學意義（P＞0．05）。結論貴陽地區幽門螺桿菌毒力基因vac A以s1a－m2型為主，cag A陰性比例高于cag A陽性，不同基因型菌株與消化性疾病間無明顯相關性。

幽門螺桿菌；毒力基因；上消化道疾病

幽門螺桿菌（Hp）是慢性活動性胃炎的病原菌，消化性潰瘍和胃MALT淋巴瘤的重要致病因子，與胃癌的發生密切相關。Hp感染人群大多無癥狀，只有少數人可表現不同程度的癥狀，目前認為與宿主易感性、環境因素及Hp菌株的毒力差異相關［1］。Hp的毒力基因為vac A、cag A 和ice A［2］。空泡毒素基因（vac A）編碼產生空泡毒素（Vac A），可引起胃粘膜上皮細胞損傷。vac A結構復雜，主要由信號序列（s區）和中間區域（m區）兩個可變區組成。信號序列將HP分為sla、slb、s2三種基因型，中間區域分為m1、m2基因型。研究表明，不同Hp菌株的vac A基因型致病能力存在差異。cag A基因編碼細胞毒素相關蛋白A，cag A致病島是Hp引起胃腸疾病的主要因素。攜帶接觸誘導基因（ice A）的Hp菌株與消化性潰瘍和胃粘膜IL－8水平顯著相關。尿素酶是尿素酶基因的編碼產物，其中ureA為結構基因，尿素酶能使Hp定植于胃粘膜上皮細胞，是Hp感染的首要因素。本研究采用PCR方法對貴陽地區分離的Hp臨床菌株進行了ureA、cag A、vac A和iceA基因型檢測，以了解貴陽地區Hp的優勢基因型及與不同疾病的關系。

1 材料與方法

1．1 材料 哥倫比亞瓊脂、幽門螺桿菌選擇添加劑，購于北京友康基業生物技術公司；厭氧罐，微需氧產氣袋購自日本三菱化學株式會社，DP302－02柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、Hp16S r RNA引物、cag A引物、vac A及亞型引物、ure A引物 、ice A引物和2×Taq PCR Master Mix，均購自北京天根生物工程有限公司。

1．2 患者標本 共選取貴陽市第一人民醫院經內鏡或手術病理證實慢性胃炎（CG）187例、消化性潰瘍（PU）92例和胃癌（GC）24例患者胃粘膜組織標本。

1．3 Hp菌株的分離和培養 用滅菌小剪刀剪碎，接種于哥倫比亞血瓊脂培養基上，用L型玻棒將組織均勻涂布于培養基，置37℃微需氧環境中培養4 d，挑取可疑菌落增菌，獲得180株Hp疑似菌株。

1．4 Hp臨床分離菌株的鑒定 可疑細菌經革蘭氏染色形態學、尿素酶試驗鑒定后，采用DP302－02柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，分別提取180株菌株的總DNA，以此作為模板，進行Hp菌種特異性16S r DNA的PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測對其進行［3］。

1．5 Hp 菌株的ure A、cag A 、vac A、iceA 基因及亞型檢測 參考文獻［4］合成 Hp的ure A、cag A、iceA和vac A基因的引物。以經形態學、尿素酶試驗和16S r DNA鑒定為Hp的臨床菌株的總DNA作為模版，分別采用相應引物進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．6 統計學分析 用SPSS11．5軟件，采用χ2檢驗，對基因分型結果及與不同疾病的關系進行統計學分析處理。

2 結 果

2．1 Hp菌株的鑒定 303例胃粘膜標本共分離出180株革蘭染色陰性螺旋狀或彎曲桿狀，尿素酶試驗陽性的菌株，經過16S r DNA的PCR檢測鑒定，其中152株為陽性，確定為Hp。

2．2 Hp臨床分離株的ure A、cag A 、vac A、ice A 基因分布：所有152例患者感染的Hp－DNA標本共檢出ure A陽性152份，陽性率100%；vac A陽性152份，陽性率100%，vac Asla基因型為94．1%（143／152），vac Aslb 基因型為5．9%（9／152），vac Am1基因型占15．8%（24／152），vac Am2基因型占81．6%（124／152），另有2．6%（4／152）的菌株不能用vac Aml和vac Am2分型。vac Asla－m2組合的基因型占76．3%（116／152），vac Asla－m1組合的基因型為15．8%（24／152），vac Aslb－m2組合的基因型為5．3%（8／152），另有4株信號序列為s1a，但中間區域不能分型。全部菌株中不存在s2基因型。vac As1a－m2型明顯多于其他型別（P＜0．05）。cag A基因陽性60份，陽性率為39．5%。56例（36．8%）為ice A1型，52例（34．2%）為ice A2型，其中20例為iceA1和iceA2混合型，24例為iceA陰性。

2．3 不同基因型與疾病的相關性 表1中可見，vac A基因中s1a型多于s1b型，m2型明顯多于m1型（P＜0．01）。vac Asla－m2組合在慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌組Hp中陽性率分別為85．2%，77．4%，72．7%；cag A 的 陽 性 率 分 別 為37．5%，39．6%，54．5%；iceA1 型 的 陽 性 率 為 35．2%，37．7%，45．5%；ice A2 型 的 陽 性 率 為 34．1%，33．9%，36．4%；不同vac A 亞型與慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌間未見明顯相關性（P＞0．05）；而ureA、cag A、iceA基因在不同臨床疾病間無統計學差異（P＞0．05）。

表1 152株臨床分離的Hp ureA、cag A、vacA、iceA在各疾病組的分布（株（%））Table 1 Status of ureA，cag A，vacA and iceA gene in patients with CG，PU and GC

3 討 論

在幽門螺桿菌的致病機制中，vac A和cag A是公認的兩種重要毒力基因。研究表明［5］vac A和cag A聯系緊密，在結構和功能上又相互獨立的毒力因子，決定著Hp毒力的高低，vac A（＋）和cag A（＋）的Hp存在致病的協同性，可加重胃粘膜炎癥和胃粘膜上皮細胞的惡化。所有的Hp菌株均含有vac A基因，但只有50%的Hp表達有空泡毒性蛋白。不同的vac A基因型別其分泌的空泡毒素在活性和量上有很大的差異。vac Asla－ml型菌株分泌的毒素活性最強，其次是s1a－m2型菌株。sla型菌株與高水平的空泡毒素活性、胃粘膜炎癥和消化性潰瘍密切相關。slb型菌株具有中等強度的致潰瘍活性，而且slb型Vac A在體外較sla型Vac A具有較弱的細胞毒活性。cag A基因表達細胞毒素相關蛋白，普遍認為攜帶cag A基因是Hp毒力較強的標志。攜帶接觸誘導基因（iceA）被認為是Hp菌株的又一毒力基因，攜帶有ice A的Hp菌株與消化性潰瘍顯著相關。iceA存在兩個基因變異體iceA 1和ice A2。

Hp基因型流行病學狀況在世界范圍內存在地理差異性，地區間的差異和相似可能提示Hp的流行趨勢、傳播方向和來源［6］。我國上海的研究發現當地vac A基因型均為s1a－m2型，廣東地區則以s1a－m2型為主。Hp菌株的cag A基因檢出率在西方國家約60%，而日本、中國等亞太國家分離的Hp菌株cag A 基因檢出率可高達90%。iceA1和ice A2的單獨檢出率在各地報道中差異很大，我國同其他東南亞地區以iceA1型感染為主。

本研究通過對貴陽地區分離的Hp菌株進行了ureA、cag A 、vac A、iceA 基因檢測，結果見：Hp ure A基因檢出率為100%；Hp vac A基因分型有s1a－m2型，s1a－m1型，s1b－m2型，沒有發現s2型，其中s1a－m 2型為最主要的優勢基因型，占76．3%，這與中國各地的報道一致，在本研究中有4株Hp菌株vac Am區基因PCR擴增陰性，不能用m1和m2分型，其他文獻亦有報道［7］，是否出現變異或其他新的分型，需要進一步試驗驗證；cag A基因的檢測陽性率為39．5%，遠低于國內外文獻報道數值，結果表明cag A陰性菌株亦可引起消化系統病變，但ca－g A的存在是否與胃粘膜病變的嚴重程度相關有待進一步證實；ice A1基因單獨檢出率36．8%，ice A2基因單獨檢出率為34．2%，兩基因型的分布未見顯著差異。

結果說明Hp的毒力基因在貴陽地區的流行分布有自己的特點，以cag A陰性，vac A s1a－m2型為主。未發現基因型與慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌間存在相關性。

［1］Rad R，Dossumbekova A，Neu B，et al．Cytokine gene polymorphisms influence mucosal cytokine expression，gastric inflammation，and host specific colonisation during Helicobacter pylori infection［J］．Gut，2004，53（8）：1082－1089．

［2］Gonzalez CA，Pena S，Capella G．Clinical usefulness of virulence factors of Helicobacter pylori as predictors of the outcomes of infection．What is the evidence［J］．Scandinavian Journal of Gastroenterology，2003，38（9）：905－915．

［3］吳曉娟，陳崢宏，王菲．PCR擴增16Sr DNA在幽門螺桿菌感染診斷中的運用［J］．現代檢驗醫學雜志．2010，25（5）：76－78．

［4］Van Doorn LJ，Figueiredo C，Sanna R，et al．Clinical relevance of the cag A，vac A and ice A status of Helicobacter pylori［J］．Gastroentrology，1998，115（1）：58－66．

［5］Salih BA．The role of the putative virulence markers（cag A and vac A）of Helicobacter pylori in peptic disease［J］．Saudi Med J，2004，25（7）：830－836．

［6］Atherton JC，Peek RM Jr，Tham KT，et al．Clinical and pathological importance of heterogeneity in vac A，the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori［J］．Gastroenterology，1997，112（1）：92－99．

［7］孫劍剛，張正茂，田擁軍，等．湖北地區幽門螺桿菌vac A基因分型及疾病相關性分析［J］．山東醫藥，2006，46（31）：11－12．

Helicobacter pylori ureA，cag A，vacA and iceA status of Guiyang area and relationship to clinical outcomes

WANG Fei，KANG Pei－ping，WU Xiao－juan，CHEN Zhen－hong
（Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China）

In order to study the distribution of vac A subtype and cag A，ureA and iceA gene of Helicobacter pylori（Hp）as well as the relationship between the presence of specific genotypes and upper gastrointestinal disease in Guiyang area，the Hp strains were isolated from the gastric mucous membrane tissue，and identified by PCR of 16sr DNA．Gene cag A、ureA、iceA and gene vac A subtypes of 152 Hp strains were typed using PCR with specific primers．Among 152 Hp－positive samples，the prevalence of ureA and vac A were 100%．It was primarily s1a－m2 in Guiyang area．The prevalence of iceA1 was 36．8%，ice A2 was 34．2%，iceA1 and iceA2 were both found in 13．2%．Results indicated that upper gastrointestinal diseases infection with Hp strains of vac A s1a－m2 subtype dominate in Guiyang area．

Helicobacter pylori；vac A；cag A；ureA ；iceA ；upper gastrointestinal disease

R378．99

A

1002－2694（2011）10－0918－03

＊貴州省科技廳基金資助項目（黔科合J字［2009］2086號）

陳崢宏，Email：czh009219＠gmc．edu．cn

貴陽醫學院微生物學教研室，貴陽 550004

2011－05－17；

2011－07－09