LAMP（環介導等溫擴增）的原理及在寄生蟲檢測上的應用＊

史亞東，趙子方，朱 丹，張龍現，寧長申，菅復春

LAMP（環介導等溫擴增）的原理及在寄生蟲檢測上的應用＊

史亞東，趙子方，朱 丹，張龍現，寧長申，菅復春

2000年，Notomi等［1］建立了一種快速、簡單、靈敏、特異并且低成本的核酸擴增方法——環介導等溫擴增法（LAMP），這種新穎的核酸擴增方法具有許多優勢［2－4］：（1）擴增效率極高，60min內擴增產物可達到靶基因的109～1010倍；（2）操作簡單，只需在65℃左右的恒溫條件下將反應物混合即可，不需要復雜的溫度變化過程；（3）靈敏性高，擴增模板只需10拷貝或更少；（4）特異性高，設計4條引物識別靶基因上6個不同區域；（5）結果判定簡單，可以通過反應副產物直接肉眼觀察，也可以通過濁度儀實時監控，無需電泳。LAMP方法的這些優勢，使其短時間內在病毒、微生物、寄生蟲等檢測上廣泛應用。以下就LAMP方法的原理及在寄生蟲檢測上的應用，簡述如下。

1 LAMP原理［1，5］

1.1 引物 LAMP方法需要根據靶基因設計兩對特殊引物，分別是內引物FIP和BIP、外引物F3和B3。它們特異識別靶基因的6個不同區域：3′端的F3c、F2c、F1c和5′端的B1、B2、B3。FIP由F2（與F2c互補）和F1c構成；BIP由B2（與B2c互補）和B1c構成，如圖1。

圖1 LAMP的引物組成及對應區域

LAMP方法的引物設計較為復雜，但有專門軟件可以設計LAMP引物，這使LAMP方法變的很易操作，Eiken GENOME SITE網站（http：//primerexplorer.jp/e/）專門開發了 LAMP引物設計軟件，研究者可以通過該軟件獲得精準的LAMP引物。

1.2 循環過程 在65℃左右時，DNA雙鏈處于解鏈和聚合的動態平衡中，一個LAMP引物可以和靶基因鏈的一端互補結合，然后開始利用DNA聚合酶通過鏈置換作用合成DNA，置換并釋放出一條單鏈DNA，這不像PCR方法那樣需要通過熱變性來得到單鏈DNA。下面就從FIP釋放單鏈DNA開始說明LAMP的擴增機制。

通過鏈置換作用，DNA聚合酶從FIP上F2的3＇端開始合成一條和靶基因鏈互補的DNA鏈。接著，F3和F3c區域互補結合，在靶基因鏈通過DNA聚合酶合成DNA，并置換出FIP結合的互補鏈。F3依照靶基因鏈合成一個互補鏈，這樣就形成了一個雙鏈DNA。F3引物合成新DNA鏈并把原來的DNA鏈置換出，這樣FIP結合的互補鏈就被釋放。然后，因為F1c區域和F1區域互補，被釋放的單鏈DNA就在其5＇端形成一個莖環結構。上面形成的單鏈DNA作為一個模板用于BIP啟動DNA合成，也用于后來的B3引物通過鏈置換進行DNA合成。BIP與在上面形成的DNA鏈結合，從BIP的3＇端開始合成互補DNA鏈。通過這個過程，DNA由環狀結構恢復成線性結構。B3引物在BIP的外側通過DNA聚合酶的活動從3＇端開始進行復性過程，BIP合成的DNA在B3引物合成DNA之前被置換釋放出來。經過上面的過程就產生了雙鏈DNA。而BIP結合的互補鏈被置換后在兩端各自形成環莖結構，類似于啞鈴結構，如圖2。

圖2 啞鈴結構

啞鈴結構是LAMP循環的起始結構，它以自身為模板，由3’末端F1啟動合成；與此同時，FIP結合于啞鈴狀結構的F2c上啟動合成。隨后，在啞鈴結構中新合成的3’末端B1c與B1互補形成莖環結構，并以B1引物自身為模板啟動合成，并釋放出剛剛FIP引導合成的互補鏈。如此往復，形成新的莖環結構又引導合成互補鏈。最終形成許多長短不一的DNA鏈，但都是靶基因的整數倍。如圖3。

圖3 LAMP循環過程

1.3 產物分析 LAMP方法擴增產物的檢測可通過以下4種方式進行：（1）LAMP擴增副產物焦磷酸鎂為白色沉淀，可肉眼觀察，如果有擴增產物，可以看到白色沉淀；反之，則沒有；（2）SYBR Green I檢測，在反應液中加入SYBR Green I，可在紫外燈或日光下通過肉眼進行擴增結果判定。如果含有擴增產物，反應混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變；（3）副產物焦磷酸鎂的濁度檢測，這種檢測方式具有極高的特異性，使用濁度儀可以判斷擴增發生與否，也可進行實時監控；（4）瓊脂糖電泳檢測，LAMP擴增產物為靶基因的整數倍，擴增產物經瓊脂糖電泳后形成特征性梯狀條帶。

2 LAMP方法在寄生蟲檢測上的應用

近年來，LAMP方法在寄生蟲檢測上的應用得到了快速發展，表1列出了一些學者用LAMP方法檢測寄生蟲的一些內容。

2.1 原蟲

2.1.1 錐蟲 Thekisoe等［2］用不同方法檢測實驗感染豬的伊氏錐蟲，結果表明LAMP方法同樣具有較好的特異性和敏感性。Thekisoe等［6］后來又建立了種屬特異性錐蟲病的LAMP檢測技術，用于檢測布氏岡比亞錐蟲、剛果錐蟲、克氏錐蟲和伊氏錐蟲，可以檢測錐蟲DNA的最低限度是1fg，在錐蟲病的田間和實驗室診斷中具有很好前景。

2.1.2 隱孢子蟲 隱孢子蟲病是一種重要的人獸共患病，據報道［31］會導致艾滋病等免疫缺陷或抑制病人的因嚴重腹瀉而死亡。Karanis等［8］等利用LAMP技術進行了動物隱孢子蟲的檢測研究，根據微小隱孢子蟲60－kDa糖蛋白（gp60）基因設計引物，并以蒸餾水、正常牛血、布氏錐蟲、牛巴貝斯蟲等作為對照，驗證LAMP方法的特異性，結果只有微小隱孢子蟲電泳出現梯狀條帶。其研究還進行了敏感性實驗，證明LAMP方法至少可以檢測到一個卵囊。所建立的方法可以快速對動物糞便和環境樣品判斷是否有隱孢子蟲，方便調查隱孢子蟲病的流行情況。

2.1.3 弓形蟲 人的先天性弓形蟲病在胎兒或嬰兒可出現發育畸形、智力障礙、腦炎甚至死亡等臨床癥狀。Sotiriadou等［11］建立了檢測水中弓形蟲的LAMP方法。根據B1和TgOWP基因建立的方法檢測極限為0.1個速殖體的DNA，與巢式PCR同時檢測26個含有已知數目卵囊的水樣，LAMP的檢出率為100%，而巢式PCR為53.8%；又用自然水樣來比較LAMP、PCR和免疫熒光試驗3種檢測方法，結果LAMP方法弓形蟲檢出率明顯高于另外兩種方法。

2.1.4 泰勒蟲 Thekisoe等［14］利用小泰勒蟲的PIM和p150基因建立LAMP方法，分別設計引物，每組靶基因引物包括6個引物，可以識別靶基因上的8個不同區域，這樣可以高特異地檢出小泰勒蟲。每個引物組的檢出限度是1fg，相當于小泰勒蟲PIM或p150基因的1個拷貝。利用PIM和p150設計的LAMP引物組可以從不同國家的家畜和水牛隔離群中擴增出小泰勒蟲。

2.1.5 巴貝斯蟲 Iseki等［17］設計了針對牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲棒狀體聯合蛋白－1基因（rhoptry－associated protein－1genes）的兩套 LAMP引物，進行擴增試驗，兩條引物完成了各自的擴增，并且通過后來的酶切片段不同加以區分，建立了同時檢測牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的多重LAMP方法。此法檢測牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的敏感性比常規PCR分別高出103和105倍。

2.1.6 瘧原蟲 瘧疾是世界六大熱帶病和我國五大寄生蟲病之一，人體的瘧原蟲有4種：間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲。Han等［20］用根據人瘧原蟲18SrDNA建立LAMP方法可以檢測人體的4種瘧原蟲，檢測三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲的極限為10拷貝，而對于惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的檢測極限為100拷貝。與顯微鏡檢相比其顯示了較高的敏感性和特異性；與巢式PCR相比其檢出率相符，但出結果時間更短。

表1 近年來LAMP方法在寄生蟲檢測中的一些應用

2.1.7 孢子蟲 楊秋林等［24］根據卡氏肺孢子蟲線粒體核糖體大亞基（mtrRNA）基因設計引物利用LAMP方法檢測該蟲。以結核桿菌、弓形蟲、大鼠白細胞等為對照，將卡氏肺孢子蟲DNA 10倍稀釋后同時進行LAMP和PCR，比較兩者的敏感性。結果卡氏肺孢子蟲檢測為陽性，對照組均為陰性。卡氏肺孢子蟲LAMP產物經電泳后呈特征性梯狀條帶，擴增產物經Tail限制性內切酶酶切鑒定正確，對照組也均無擴增產物。LAMP可檢測到蟲體DNA的最低濃度是1Pg/μL，為PCR的10倍。

2.1.8 賈第蟲 盧濰媛等［26］根據藍氏賈第鞭毛蟲rRNA序列設計4條特異引物建立了檢測該蟲的LAMP方法。以隱孢子蟲卵囊、瘧原蟲為對照，并將純水作為陰性對照，結果藍氏賈第鞭毛蟲檢測為陽性；對照組均為陰性。且與LAMP產物瓊脂糖凝膠電泳分析結果一致。

2.2 吸蟲 Cai等［28］利用華支睪吸蟲組織蛋白酶B3基因建立LAMP的方法能夠敏感、快速的檢測魚是否感染華支睪吸蟲，而且實驗中的肝片吸蟲、日本血吸蟲等對照沒有發生交叉反應，試驗中LAMP檢測華支睪吸蟲的敏感性為常規PCR的100倍。該方法為檢測魚的華支睪吸蟲提供了一個快速、敏感的工具，這為預防人的華支睪吸蟲病提供了有效的手段。

2.3 絳蟲 Nkouawa等［29］根據絳蟲組織蛋白酶樣半胱氨酸肽酶（CLP）和細胞色素C氧化酶亞基1（Cox1）基因設計LAMP引物，建立的檢測絳蟲的LAMP方法。其中根據Cox1基因建立的LAMP方法可以區分3個種，而根據CLP基因建立的LAMP可以區分有鉤絳蟲和無鉤絳蟲或亞洲帶絳蟲，通過限制性酶消化LAMP產物又可區分無鉤絳蟲和亞洲帶絳蟲。

2.4 線蟲 鄭洋妹等［30］根據簡單異尖線蟲ITS保守區域序列設計引物建立了快速鑒定該蟲的LAMP方法。優化后對10倍比稀釋的簡單異尖線蟲ITS序列重組質粒進行靈敏性試驗；用典型異尖線蟲、對盲囊線蟲、針蛔線蟲作為對照進行特異性試驗；并將7份簡單異尖線蟲樣品進行驗證試驗。結果檢測簡單異尖線蟲的靈敏度達到10拷貝/μL，且對照均無交叉反應，7份簡單異尖線蟲樣品檢驗為陽性。所建立的LAMP方法靈敏性高、特異性強，是鑒定簡單異尖線蟲的有效手段。

3 展 望

LAMP作為一種新穎的核酸擴增方法，在短短10年內，以其顯著優勢被研究者們廣泛應用于分子檢測，其發展前景非常廣闊。雖然它的引物設計過程繁復，但是引物設計可以由相關研究單位和試劑公司來完成，對于操作人員來說是極為簡單，只需要把處理好的樣本和LAMP相關試劑一起放入65℃恒溫水浴中，1h左右就能通過肉眼報告結果。這點作為臨床檢測具有很大意義，可開發成LAMP檢測試劑盒，便于廣大基層醫療衛生單位檢驗人員使用。總之，隨著LAMP技術的不斷完善和改進，相信LAMP方法將在寄生蟲病的分子診斷及檢測中發揮更大的作用。

［1］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（12）：63.

［2］Thekisoe OM，Inoue N，Kuboki N，et al.Evaluation of loopmediated isothermal amplification（LAMP），PCR and parasitological tests for detection ofTrypanosomaevansiin experimentally infected pigs［J］.Veterinary Parasitology，2005，130（3－4）：327－330.

［3］Soliman H，EI－Matbouli M.Reverse transcription loop－mediated isothermal amplification（RT－LAMP）for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus（VHS）［J］.Veterinary Microbiology，2006，114（3－4）：205－213.

［4］潘樹德，劉寶山，劉金鈴，等.環介導等溫擴增技術及其在病原檢測中的應用［J］.動物醫學進展，2009，30（2）：74－77.

［5］Nagamine K，Hase T，Notomi T.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers［J］.Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223－229.

［6］Thekisoe OM，Kuboki N，Nambota A，et al.Species－specific loop－mediated isothermal amplification（LAMP）for diagnosis of trypanosomosis［J］.Acta Tropica，2007，102（3）：182－189.

［7］Njiru ZK，Mikosza AS，Matovu E，et al.African trypanosomiasis：Sensitive and rapid detection of the sub－genusTrypanozoonby loop－mediated isothermal amplification（LAMP）of parasite DNA［J］.International Journal for Parasitology，2008，38（5）：589－599.

［8］Karais P，Thekisoe O，Kioiptsi K，et al.Development and preliminary evaluation of a loop－mediated isothermal amplification procedure for sensitive detection ofCryptosporidiumoocysts in fecal and water samples［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73（17）：5660－5662.

［9］Bakheit MA，Torra D，Plaomino LA，et a1.Sensitive and specific detection ofCryptosporidiumspecies in PCR－negative samples by loop－mediated isothermal DNA amplification and confirmation of generated LAMP products by sequencing［J］.Veterinary Parasitology，2008，158（1－2）：11－22.

［10］袁忠英，沈玉娟，曹建平，等.環介導等溫擴增技術檢測牛源隱孢子蟲的研究［J］.國際醫學寄生蟲病雜志，2009，36（3）：144－146.

［11］Sotiriadou I，Karanis P.Evaluation of loop－mediated isothermal amplification for detection ofToxoplasmagondiiin water samples and comparative findings by polymerase chain reaction and immunofluorescence test（IFT）［J］.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2008，62（4）：357－365.

［12］Alhassan A，Thekisoe OM，Yokoyama N，et al.Development of loop－mediated isothermal amplification（LAMP）method for diagnosis of equine piroplasmosis［J］.Veterinary Parasitology，2007，143（2）：155－160.

［13］Liu Z，Hou J，Bakheit MA，et al.Development of loop－mediated isothermal amplification（LAMP）assay for rapid diagnosis of ovine theileriosis in China［J］.Parasitology Research，2008，103（6）：1407－1412.

［14］Thekisoe OMT，ambritch NE，Nakao R，et al.Loop－mediated isothermal amplification（LAMP）assays for detection ofTheileriaparvainfections targeting the PIM and p150genes［J］.International Journal for Parasitology，2010，40（1）：55－61.

［15］王中光，張守發，曹世諾，等.牛瑟氏泰勒蟲環介導等溫擴增檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2010，32（2）：108－111.

［16］Ikadai H，Tanaka H，Shibahara N，et al.Molecular evidence of infections withBabesiagibsoniparasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop－mediated isothermal amplification method［J］.Journal of Clinical Microbiology，2004，42（6）：2465－2469.

［17］Iseki H，Alhassan A，Ohta N，et al.Development of a multiplex loop－mediated isothermal amplification（mLAMP）method for the simultaneous detection of bovineBabesiaparasites［J］.Journal of Microbiological Methods，2007，71（3）：281－287.

［18］Guan G，Chauvin A，Luo J，et a1.The development and evaluation of a loop－mediated isothermal amplification（LAMP）method for detection ofBabesiaspp.infective to sheep and goats in China［J］.Experimental Parasitology，2008，120（1）：39－44.

［19］He L，Zhou YQ，Oosthuizen M C，et al.Loop－mediated isothermal amplification（LAMP）detection ofBabesiaorientalisin water buffalo（Bubalusbabalis，Linnaeus，1758）in China.VeterinaryParasitology，2009，165（1－2）：36－40.

［20］Han ET，Watanabe R，Sattabongkot J，et al.Detection of four Plasmodium species by genus－and species－specific loop－mediated isothermal amplification for clinical diagnosis［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，45（8）：2521－2528.

［21］Aonuma H，Suzuki M，Iseki H，et al.Rapid identification ofPlasmodium－carrying mosquitoes using loop－mediated isothermal amplification［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，376（4）：671－676.

［22］El－Matbouli M，Soliman H.Development of a rapid assay for the diagnosis ofMyxoboluscerebralisin fish and oligochaetes using loop－mediated isothermal amplification［J］.Journal of Fish Diseases，2005，28（9）：549－557.

［23］El－Matbouli M，Soliman H.Rapid diagnosis ofTetracapsuloidesbryosalmonae，the causative agent of Proliferative kidney disease（PKD）in salmonid fish by a novel DNA amplificaiton method，loop－mediated isothermal amplification（LAMP）［J］.Parasitology Research，2005，96（4）：277－284.

［24］楊秋林，張如勝，伍和平，等.環介導等溫擴增技術檢測卡氏肺孢子蟲的研究［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2008，28（6）：565－567.

［25］金超，賈立軍，曹世諾，等.牛新孢子蟲病LAMP檢測方法的建立［J］.中國獸醫科學，2009，39（12）：1084－1088.

［26］盧濰媛，袁忠英，沈玉娟，等.環介導等溫擴增技術檢測藍氏賈第鞭毛蟲［J］.國際醫學寄生蟲病雜志，2010，37（3）：145－147.

［27］Xu J，Rong R，Zhang HQ，et al.Sensitive and rapid detection ofSchistosomajaponicumDNA by loop－mediated isothermal amplification（LAMP）［J］.International Journal for Parasitology，2010，40（3）：327－331.

［28］Cai XQ，Xu MJ，Wang YH，et al.Sensitive and rapid detection ofClonorchissinensisinfection in fish by loop－mediated isothermal amplification（LAMP）［J］.Parasitology Research，2010，106（6）：1379－1383.

［29］Nkouawa A，Sako Y，Nakao M，et a1.Loop－mediated isothermal amplification method for differentiation and rapid detection ofTaeniaspecies［J］.Journal of Clinical Microbiology，2009，47（1）：168－174.

［30］鄭洋妹，陳信忠，龔艷清，等.簡單異尖線蟲環介導等溫擴增（LAMP）鑒定方法的建立和應用［J］.國際醫學寄生蟲病雜志，2010，37（3）：141－144.

［31］Xiao L，Fayer R，Ryan U，et al.Cryptosporidiumtaxonomy：recent advances and implications for public health［J］.Clinical Microbiology Reviews，2004，17（1）：72－97.

R181.2

A

1002－2694（2011）10－0935－05

＊河南省科技廳重點科技攻關項目（92102110138）資助

菅復春，Email：jfchun2008＠yahoo.com.cn

河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002

2011－03－16；

2011－06－02