1例國內罕見的輸入性卵形瘧的實驗室檢測＊

師永霞，黃吉城，蘇錦坤，李小波，幸蘆琴，鄭 夔，洪 燁，郭波旋

1例國內罕見的輸入性卵形瘧的實驗室檢測＊

師永霞，黃吉城，蘇錦坤，李小波，幸蘆琴，鄭 夔，洪 燁，郭波旋

目的 對1例輸入性疑似瘧疾患者的血樣進行實驗室檢測。方法 制備疑似瘧疾患者血樣的血涂片，吉姆薩染色后進行瘧原蟲的鏡檢觀察。利用實驗室自行研制的瘧原蟲屬特異性（通用型）和4種瘧原蟲種特異性的巢式PCR和實時熒光PCR檢測方法，對該血樣進行瘧疾檢測及分型。將PCR擴增片段進行序列測定，并與已知的卵形瘧序列進行blast比對分析。結合血樣的分子生物學檢測結果，重新對鏡檢結果進行復核。結果 血樣初次鏡檢為瘧疾陰性。使用瘧原蟲巢式PCR通用引物對血樣的DNA進行PCR檢測，擴增出了預期大小約240bp的條帶；巢式PCR分型檢測表明，血樣僅擴增出預期大小約450bp的卵形瘧條帶，無對應大小的惡性瘧、間日瘧和三日瘧擴增條帶產生。瘧原蟲通用型和卵形瘧特異性的熒光PCR檢測結果均為典型的S形陽性曲線，卵形瘧擴增片段的熔解溫度為72.5℃。序列分析表明，擴增片段長度為434bp，blast比對發現去除引物后的393個堿基與GenBank DQ845247等卵形瘧的SSU rRNA對應部分的基因序列同源性為100%。重新對血涂片進行鏡檢復核，結果在薄血膜中發現了卵形瘧的環狀滋養體，被寄生的紅細胞為橢圓形，邊緣呈傘矢狀。結論 使用巢式PCR、實時熒光PCR、序列分析和鏡檢等方法，證實該例輸入性的疑似瘧疾患者為卵形瘧原蟲感染。

輸入性卵形瘧；鏡檢；巢式PCR；實時熒光PCR；序列分析

卵形瘧原蟲感染經常發生在中東、西非和印度尼西亞等地，在東南亞泰緬邊界和孟加拉國境內也有卵形瘧的發病報道［1－3］。我國本土瘧疾以間日瘧為主，其次是惡性瘧，三日瘧偶爾可見，卵形瘧已無報告。卵形瘧原蟲感染者血中蟲體數量少，在厚血膜中易與間日瘧和三日瘧原蟲混淆，不易識別，僅有薄血片可用于形態學診斷，所以使用傳統的吉姆薩染色觀察法進行鏡檢時易對卵形瘧原蟲感染漏檢［4］。本研究將傳統鏡檢法與巢式PCR和實時熒光PCR等分子生物學檢測技術相結合，對一例國內罕見的輸入性卵形瘧原蟲感染進行了實驗室檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 入境旅客卞某的EDTA抗凝血樣，4℃保存。該旅客在赤道幾內亞國家工作兩年，期間染瘧疾，曾多次反復發作，入境時查體為38.3℃。

1.1.2 主要試劑 核酸提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Extraction Minikit）和SYBR熒光PCR試劑（QuantiTect SYBR Green PCR Kit）購自 Qiagen公司，探針法熒光PCR試劑（TaqMan○RFast U－niversal PCR Master Mix（2×）購自ABI公司，Taq酶購自Roche公司，100bp DNA Ladder Marker和瓊脂糖購自TaKaRa公司，吉姆薩染色液購自珠海貝索生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針設計 根據瘧原蟲的小亞單位核糖體核糖核酸 （small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因序列［5］，設計了瘧原蟲屬特異性和四種瘧原蟲種特異性引物和探針，序列見表1，用于瘧疾巢式PCR和實時熒光PCR檢測及分型。合成上下游引物間的DNA片段作為PCR擴增時的陽性對照。引物、探針和DNA片段委托上海生工生物技術有限公司合成。

表1 瘧原蟲檢測的引物和探針Table 1 Primers and probes used to detect Plasmodium

1.2.2 巢式PCR 設反應總體系25μL，PCR第1次擴增體系包括 PCR buffer 2.5μL、10μmol/L dNTP 0.5μL、10μmol/L 引 物 rPLUout－FP 和rPLUout－RP各0.5μL、Taq酶0.25μL、無菌雙蒸水15.75μL、DNA模板5μL，混勻后進行PCR反應。PCR反應程序為：94℃2min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，35個循環；72℃ 10min；4℃。巢式PCR第2次擴增體系包括PCR buffer 2.5μL、10μmol/L dNTP 0.5μL、10μmol/L 通用型上下游引物rPLUin－FP、rPLUin－RP各0.5μL或4種瘧原蟲特異性上下游引物各0.5μL、Taq酶0.25μL、無菌雙蒸水18.75μL以及2μL第1次PCR產物；同時設立陰性和陽性對照，陰性對照使用無菌水，陽性對照使用合成的瘧疾DNA片段。PCR反應程序為：94℃2min；94℃1min，58℃1 min，72℃1min，35個循環；72℃10min；4℃。

1.2.3 實時熒光PCR檢測 瘧原蟲通用熒光PCR檢測采用探針法進行，反應總體積20μL，包括Master Mix 10μL、10μmol/L 引 物 Plas－FP 和Plas－RP各 1μL、5μmol/L 探針 Plas－Pro 1μL、DNA 7μL，同時分別以DEPC H2O和DNA陽性模板作為陰性和陽性對照。擴增和檢測在ABI 7900HT Fast熒光定量PCR儀器上進行，反應程序為：95℃20s；95℃1s，58℃20s（收集熒光），40個循環。采用染料摻入法進行卵形瘧的實時熒光PCR檢測，反應體系為25μL，包括2×PCR buffer 12.5μL、10μmol/L上下游引物OVA－FP和OVARP各0.75μL、DEPC H2O 9μL以及瘧原蟲模板DNA 2μL。實時熒光PCR反應程序為：95℃15 min；94℃15s，50℃30s，72℃30s（收集熒光），40個循環；最后對PCR產物進行熔解曲線分析。

1.2.4 擴增產物電泳分析 取5μL擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，GelGreen染色，凝膠成像系統觀察結果并拍照。

1.2.5 序列測定和分析 擴增的PCR片段由上海英駿生物技術有限公司進行序列測定，再對堿基組成進行blast比較分析。使用DNASTAR軟件對該序列與其他卵形瘧序列進行比對并進行進化樹分析。

2 結 果

2.1 血樣的鏡檢分析 制備血樣的厚血膜和薄血膜涂片，吉姆薩染色后進行油鏡觀察。初次鏡檢判斷為陰性，復核時在薄血膜中發現了卵形瘧的環狀滋養體，被寄生的紅細胞為橢圓形，邊緣呈傘矢狀（圖1）。

圖1 血涂片吉姆薩染色鏡檢觀察Fig.1 Microscopic observation of Giemsa stained blood smears.

2.2 血樣的巢式PCR檢測 提取血樣的DNA進行瘧疾的通用型和特異性的巢式PCR檢測，結果如圖2和圖3。使用瘧疾的通用引物PCR擴增出了預期大小約240bp的條帶（圖2），使用卵形瘧的特異性引物PCR擴增出了預期大小約450bp的條帶（圖3），惡性瘧、間日瘧和三日瘧引物對沒有擴增條帶產生。

2.3 血樣的實時熒光PCR檢測 瘧原蟲屬特異性的熒光PCR檢測結果顯示（見圖4），血樣擴增出了典型的S形曲線，為瘧疾陽性。進一步的瘧原蟲特異性熒光PCR檢測結果表明，該患者為卵形瘧感染（圖5），擴增片段的Tm值為72.5℃（圖6）。

2.4 擴增片段的序列分析 將輸入性卵形瘧的巢式PCR擴增片段送去測序。序列分析表明，擴增片段長度為434bp，將該序列遞交到GenBank上，GenBank登錄號為JF505386。blast比對發現去除引物后的393bp擴增片段與卵形瘧SSU rRNA（GenBank 登 錄 號 為 DQ845247、AB182491、AB182492、AB182493、AJ001527和 X99790）對應部分的基因序列同源性為100%。

3 討 論

為了響應聯合國千年發展目標高級別會議提出的在全球根除瘧疾的倡議，衛生部制定和頒布了“中國消除瘧疾行動計劃（2010－2020年）”，但在我國，周邊的緬甸、老撾等東南亞國家和與我國直航的非洲等傳統瘧疾高發地區帶來的輸入性瘧疾疫情為我國瘧疾防治工作帶來日益嚴重的威脅。目前瘧疾診斷以鏡檢為主，它不但需要操作者具有豐富的經驗，而且有一定的局限性。當血中原蟲密度較低（＜50個/μL）時，靠鏡檢難以查到原蟲，容易出現漏診［7］；由于國內少見三日瘧和卵形瘧，容易將兩者誤判為形態和臨床癥狀相似的間日瘧和惡性瘧［1－2］；當發生瘧原蟲混合感染時，容易出現誤診［8－10］；鏡檢耗時，不適用于大量人群的篩查。

本研究對一例來自非洲赤道幾內亞國家的入境、疑似瘧疾旅客的血樣進行了實驗室檢測。血涂片初次鏡檢結果為瘧疾陰性，但該血樣的屬特異性巢式PCR和屬特異性的實時熒光PCR檢測均為瘧原蟲核酸陽性。進一步的種特異性巢式PCR檢測發現，血樣擴增出了卵形瘧預期大小約450bp的條帶，無其它種類瘧原蟲混合感染。利用染料摻入法進行卵形瘧的特異性實時熒光PCR檢測，血樣的檢測結果為卵形瘧陽性，擴增片段特異性好，Tm為72.5℃。序列分析表明，雖然用于PCR擴增的上游引物和下游引物的序列與GenBank DQ845247、AB182491等卵形瘧對應部分分別有3個和1個堿基不同，但去除引物后的擴增片段堿基組成與上述卵形瘧的序列完全相同，這證實了該例瘧疾為輸入性卵形瘧，說明在非洲中西部國家有卵形瘧的分布。隨后，我們對血涂片進行復核，結果在薄血膜中發現了卵形瘧的環狀滋養體，形態與間日瘧相似；被寄生的紅細胞為橢圓形，邊緣呈傘矢狀。這表明使用傳統的鏡檢法易對卵形瘧原蟲感染漏檢，與Win等研究結果相似［1］。

［1］Win TT，Lin K，Mizuno S，et al.Wide distribution ofPlasmodiumovalein Myanmar［J］.Trop Med Int Health，2002，7（3）：231－239.

［2］Zhou M，Liu Q，Wongsrichanalai C，et al.High prevalence ofPlasmodiummalariaeandPlasmodiumovalein malaria patients along the Thai－Myanmar border，as revealed by acridine orange staining and PCR－based diagnoses［J］.Trop Med Int Health，1998，3（4）：304－312.

［3］Fuehrer HP，Starzengruber P，Swoboda P，et al.IndigenousPlasmodiumovalemalaria in Bangladesh［J］.Am J Trop Med Hyg，2010，83（1）：75－78.

［4］黃興周，趙春星，周高云.卵形瘧1例報告［J］.中國寄生蟲病防治雜志，1994，7（2）：103.

［5］Rougemont M，Van Saanen M，Sahli R，et al.Detection of fourPlasmodiumspecies in blood from humans by 18SrRNA gene subunit－based and species－specific real－time PCR assays［J］.J Clini Microbiol，2004，42（12）：5636－5643.

［6］師永霞，蘇錦坤，洪燁，等.瘧疾的實時熒光PCR快速檢測方法［J］.中國衛生檢驗雜志，2011，21（3）：625－627.

［7］Gama BE，Silva－Pires Fdo E，Lopes MN，et al.Real－time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in lowgrade parasitemia［J］.Exp Parasitol，2007，116（4）：427－432.

［8］Swan H，Sloan L，Muyombwe A，et al.Evaluation of a realtime polymerase chain reaction assay for the diagnosis of malaria in patients from Thailand［J］.Am J Trop Med Hyg，2005，73（5）：850－854.

［9］Ndao M，Bandyayera E，Kokoskin E，et al.Comparison of blood smear，antigen detection，and nested－PCR methods for screening refugees from regions where malaria is endemic after a malaria outbreak in Quebec，Canada［J］.J Clin Microbiol，2004，42（6）：2694－2700.

［10］Perandin F，Manca N，Piccolo G，et al.Identification ofPlasmodiumfalciparum，P.vivax，P.ovaleandP.malariaeand detection of mixed infection in patients with imported malaria in Italy［J］.New Microbiol，2003，26（1）：91－100.

Laboratory diagnosis of a suspected case of importedPlasmodiumovaleinfection

SHI Yong－xia，HUANG Ji－cheng，SU Jin－kun，LI Xiao－bo，XING Lu－qin，ZHENG Kui，HONG Ye，GUO Bo－xuan

（HealthQuarantineLab，GuangdongInspectionandQuarantineTechnologyCenter，GuangdongEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Guangzhou510700，China）

Blood smear of suspected imported malaria patient was prepared and observed by microscopy after Giemsa staining.Initial microscopy of the blood sample was negative for malaria.Nested PCR and real－time PCR methods of genusspecificPlasmodiumand four species－specificPlasmodiumwere performed to detect and differentiate the parasites using inhouse designed primers and probes.Nested PCR with the genus－specific primers ofPlasmodiumshowed that the blood sample produced an expected band of about 240bp in size.Plasmodiumclassification demonstrated that the blood sample only produced an expected amplification band of about 450bp ofP.ovalein size and no bands ofP.falciparum，P.vivaxandP.malarie.Real time PCR with bothPlasmodiumand specificP.ovaledisplayed typical S－shaped positive curves.Sequence analysis showed that the amplified fragment was composed of 434bases and 393bases removing PCR primers showed 100%homology to the corresponding part ofP.ovaleSSU rRNA gene of GenBank accession number DQ845247.Blood smear was reviewed by microscopy.The ring trophozoites ofP.ovalewere founded in thin blood film and the parasitized cell was oval in shape with fimbriated edges.The suspected case of imported malaria patient was confirmed to infectP.ovaleby nested PCR，real－time PCR，sequence analysis and microscopic examination.

importedPlasmodiumovale；microscopic examination；nested PCR；real time PCR；sequence analysis

R382.3

A

1002－2694（2011）10－0914－04

＊廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（No.2007GDK32）

師永霞，Email：syx0817＠yahoo.com.cn

廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心衛生檢疫實驗室，廣州 510700

2011－06－21；

2011－08－03