幽門螺桿菌抗原基因ureB在乳酸菌中的克隆表達與免疫反應性研究

張小娟，張榮光，段廣才，范青堂

2.鄭州大學河南省分子醫學重點學科開放實驗室，鄭州450001

幽門螺桿菌抗原基因ureB在乳酸菌中的克隆表達與免疫反應性研究

張小娟1，張榮光2，段廣才2，范青堂2

目的 為了開發幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）口服疫苗，將Hp尿素酶B（UreB）在食品級乳酸乳球菌NZ3900菌株中進行表達，并研究其免疫反應性。方法 PCR擴增HpMEL－HP27菌株ureB基因（基因號：FJ436980），將其克隆入大腸桿菌－乳酸乳球菌穿梭質粒pNZ8110中并轉化乳酸乳球菌NZ3900；采用正交試驗確定目的蛋白表達的適宜條件；應用western－blot鑒定其免疫反應性。結果 成功擴增了HpMEL－HP27菌株ureB基因，構建了ureB基因的乳酸菌NICE（Nisin－controlled expression）原核表達系統；UreB蛋白適宜的表達條件為：在ureB重組菌生長至對數生長前期（OD600≈0.3～0.4）加入終濃度為40ng/mL的nisin，誘導表達5h，可溶性UreB蛋白表達量最高，可達27.26μg/mL培養基。可溶性UreB蛋白的表達占上清蛋白的比例最高可達20.19%；Western－blot結果顯示乳酸乳球菌表達的UreB抗原蛋白具有良好的免疫反應性。結論 結果提示應用乳酸乳球菌構建幽門螺桿菌食品級疫苗可能具有較好前景。

幽門螺桿菌；乳酸乳球菌；NICE；UreB

2.鄭州大學河南省分子醫學重點學科開放實驗室，鄭州450001

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是一種革蘭氏陰性螺旋桿菌，能夠導致胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關淋巴瘤和胃癌［1－3］。1994年，Hp被世界衛生組織（WHO）列為Ⅰ類致癌原。此外，Hp還與糖尿病、冠心病、血小板減少性紫癜等一些腸道外疾病有重要關系［4－6］。目前Hp感染的主要治療方案是聯合應用質子泵抑制劑、鉍劑和抗生素的三聯療法，殺滅細菌效率超過90%。但是，這種治療方案仍存在以下問題：藥物療法副作用較多，如口腔異味、腹痛、惡心、嘔吐等；抗生素耐藥菌株的不斷增多；對于發展中國家感染人群來說治療費用相對昂貴等［7－8］。免疫接種有望成為預防Hp感染最有效最經濟的方法。

乳酸乳球菌（Lactococcuslactis，L.lactis）是一種革蘭氏陽性非致病性食品級細菌，通常被認為是安全的（Generallyrecognizedassafe，GRAS），已經在乳制品發酵工業方面應用上千年。由于其基因可獲得性和易操作性，乳酸乳球菌已經被廣泛用作外源蛋白表達的活菌載體。多個研究小組報告了用乳酸乳球菌表達細菌或病毒抗原基因，如：布魯氏桿菌L7/L12抗原，破傷風毒素C片段，白細胞介素2等［9－11］。為了開發幽門螺桿菌的食品級口服疫苗，本實驗PCR擴增了HpMEL－HP27ureB基因。有文獻報道，翻譯融合表達較轉錄融合表達具有更高的表達活性［12］。為構建ureB基因的翻譯融合表達系統，利用nisA啟動子NcoⅠ酶切位點上的ATG作為起始密碼子，使插入的目的基因與啟動子nisA的SD（核糖體結合位點）區構成翻譯融合，為進一步的抗原基因高效表達奠定基礎，故在引物設計中在上游引物中引入6個堿基atgggc。將經過菌液PCR和質粒雙酶切鑒定后的ureB基因克隆入乳酸乳球菌NZ3900菌株構建工程菌株NZ3900/pNZ8110－ureB，誘導重組蛋白表達，并鑒定其免疫反應性。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒 MEL－HP27菌株為本教研室保存，分離自鄭州慢性淺表型萎縮性胃炎病人。乳酸乳球菌NZ3900菌株和質粒pNZ8110購自荷蘭NIZO食品研究所。重組工程菌株TB1/pMAL－c2X－ureB為代麗萍博士構建。大腸桿菌 MC1061為中國疾病預防控制傳染病所闞彪博士惠贈。

1.2 菌株生長條件 乳酸乳球菌NZ3900生長在添加0.5% 葡萄糖的M17培養基中，30℃靜止培養。大腸桿菌MC1061生長在LB培養基中，37℃震蕩培養。

1.3 主要儀器和試劑 臺式高速離心機（德國Heraeus公司）；U－2001型紫外可見分光光度計（日本HITACHI公司）；溫度梯度基因擴增儀（德國Biomtre公司）；凝膠圖像分析儀（美國Syngene公司）；超純水系統（美國 Millipore公司）。PrimeStarTM HS DNA polymerase、T4DNA連接酶及核酸限制性內切酶購自Takara公司；凝膠回收試劑盒購自Axygen生物技術有限公司；M17培養基購自美國Difco公司；其余試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.4 PCR擴增ureB基因 基因擴增引物由北京賽百 盛 公 司 合 成，上 游 引 物 （P1）：5’－catgccatgggcatgaaaaagattagcag－3’（NcoI）；下游引物（P2）：5’－cgctctagactagaaaatgctaaagag－3’（XbaI）。引 物中下劃線部分為酶切位點，預期擴增產物長度為1716bp。PCR 循環條件：95℃ 5min；94℃ 1min，55℃1min，72℃3min，共30個循環；72℃10min。1.5 構建 NZ3900/pNZ8110－ureB重組子ureB基因PCR擴增產物經NcoI和與XbaI雙酶切后與經過同樣雙酶切的pNZ8110進行過夜連接，然后用氯化鈣法轉化大腸桿菌MC1061，轉化后的菌液涂于含有10μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃恒溫箱中培養約40h，挑取單菌落液體培養后進行菌液PCR和質粒雙酶切鑒定，同時進行測序鑒定。經過鑒定后的pNZ8110－ureB重組質粒用電轉化法轉化乳酸菌NZ3900。

1.6 正交試驗法優化表達UreB 應用誘導劑Nisin誘導UreB蛋白在乳酸菌重組子中的表達。正交試驗采用L25（56）正交表，取 A（誘導劑濃度）、B（誘導時機）、C（誘導時間）3個因素。A因素取20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL共5個水平，B因素取菌液OD600約0.10～0.15、0.15～0.20、0.20～0.30、0.30～0.40、0.40～0.60共5個水平，C因素取誘導1h、2h、3h、4h、5h共5個水平，對UreB蛋白在乳酸菌重組子中的表達條件進行優化。

1.7 小鼠抗血清制備 取活化的TB1/pMAL－c2X－ureB工程菌種子，以1%比例接種于200mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、220r/min振蕩培養2h至 OD600約為0.40～0.50時，加入誘導劑IPTG終濃度至0.3mmol/L，繼續振蕩培養4h。超聲破碎離心取上清，直鏈淀粉樹脂親和層析柱分離純化MBP－UreB融合蛋白。調整純化 MBP－UreB融合蛋白濃度為0.2μg/μL后與等體積弗氏完全佐劑混勻進行超聲乳化制備初次免疫抗原，于第1周對昆明小鼠進行初次免疫，每只小鼠兩只后腿和腹腔注射200μL初次免疫抗原。將濃度為0.2μg/μL的純化 MBP－UreB融合蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻進行超聲乳化制備加強免疫抗原，于第2周、第3周、第4周以同樣的方式注射加強免疫抗原各1次。最后1次免疫后1周，摘眼球取血，分離血清，－20℃保存備用。抗體滴度應用間接酶聯免疫吸附法（ELISA）測定。

1.8 乳酸乳球菌工程菌表達的UreB蛋白免疫反應性研究 經誘導表達UreB蛋白的乳酸乳球菌工程菌超聲破碎后取上清進行12%SDS－PAGE凝膠電泳，用Bio－Rad半干式電轉印儀轉膜，電壓20V，電轉40min。封閉后將NC膜置于用封閉液1∶100稀釋的小鼠抗血清中，37℃輕搖孵育1～2h。PBS和TBST各洗3次后將膜置于用含5% （W/V）脫脂奶粉的TBS稀釋的第二抗體中，37℃作用1～2h，TBST洗3次，每次10min。然后將膜放入平皿中，加入1mL新鮮配置的增強型辣根過氧化物酶標記的DAB顯色液，輕輕振搖，直至顯色充分，用去離水漂洗，終止顯色，將膜轉入PBS中，照相保存。

2 結 果

2.1ureB基因的PCR擴增結果 提取 MELHP27菌株的染色體DNA后，應用高保真DNA聚合酶PCR擴增ureB基因片段，PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示擴增出長度為1 716bp的ureB特異性片段（圖1）。

圖1 PCR擴增ureB基因產物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Polymerase chain reaction （PCR）products of the MEL－Hp27ureB gene.

2.2ureB基因的序列測定結果ureB基因的序列測定結果經過與GenBank上公布的Hp－MEL27ureB基因進行BLAST比對，除了添加的的atgggc 6個堿基（加下劃線部分）外，基因序列完全一致，進一步證實pMD19－T－ureB重組克隆質粒構建成功，見圖2。

2.3 菌液PCR鑒定 MC1061/pNZ8110－ureB重組子 從轉化板上挑取單菌落過夜搖菌后，50μL PCR反應體系取5μL菌液為模板，以P1、P2引物做特異PCR鑒定，擴增出1 716bp片段，與預期結果一致（圖3）。

2.4 質粒雙酶切鑒定 MC1061/pNZ8110－ureB重組子 取經過菌液PCR鑒定為陽性的MC1061/pNZ8110－ureB重組子單菌落增菌液，堿裂解法抽提質粒，用XbaⅠ單酶切和NcoⅠ、XbaⅠ雙酶切進行酶切鑒定。酶切產物行1%瓊脂糖電泳。結果顯示：單酶切產物片段長度和雙酶切產物片段長度均與預期結果一致，證實 MC1061/pNZ8110－ureB重組子構建成功（圖4）。

圖4 質粒雙酶切鑒定MC1061/pNZ8110－ureB重組子Fig.4 Identification of the recombinant MC1061/pNZ8110－ureBby restriction enzyme digestion.

2.5 正交試驗法優化UreB表達 經過對誘導劑濃度、誘導時機、誘導時間3個因素及其5個不同水平進行蛋白誘導表達條件優化，得出了UreB蛋白適宜的表達條件：在ureB重組菌生長至對數生長前期（OD600≈0.3～0.4）加入終濃度為40ng/mL的nisin，誘導表達5h，可溶性 UreB蛋白最高可達27.26μg/mL培養基?？扇苄訳reB蛋白的表達占上清蛋白的比例最高可達20.19%。

2.6 小鼠抗血清滴度ELISA測定結果 鼠抗UreB免疫血清以1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400稀釋后，與稀釋至20μg/mL的MBP－UreB融合蛋白進行抗體效價的測定，并以正常小鼠血清作為陰性對照，結果血清抗體效價為1∶800，說明制備的小鼠抗UreB免疫血清具有良好的免疫反應性。

2.7 乳酸菌表達UreB蛋白免疫反應性研究 經誘導的 NZ3900/pNZ8110－ureB工程菌超聲破碎后，離心取上清行SDS－PAGE電泳，轉膜后 Western－blot鑒定乳酸菌表達UreB蛋白的免疫反應性。結果顯示：誘導表達工程菌各孔均出現預期蛋白分子量大小為61.859kD條帶，而對照空菌NZ3900無對應條帶（圖5）。

3 討 論

Hp是流行最廣泛的人類病原體，全世界約有半數人口感染。由于疫苗被認為是防止Hp感染最經濟有效的方法，尤其是在發展中國家，因此近年來Hp疫苗的研究成為熱點。

圖5 乳酸菌表達UreB蛋白免疫反應性Western－blot鑒定結果Fig.5 Western blot analysis of UreB expressed by Lactococcus lactis transformant with polyclonal anti－UreB serum.

乳酸菌是一種革蘭氏陽性食品級細菌，長期以來廣泛應用于食品工業以生產發酵乳制品。由于乳酸菌是食品級微生物，其細胞組分或產生的酶可以部分純化或不需純化，而直接使用其天然的細胞提取物。以乳酸菌作為活菌疫苗載體在Hp的疫苗研制方面也有應用。孫振璐［13］等在乳酸菌中表達幽門螺桿菌（Hp）黏附素alpA基因，并口服免疫小鼠后檢測其免疫原性。結果顯示：表達alpA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后，能夠刺激小鼠產生特異的IgG和IgA，可作為幽門螺桿菌口服疫苗候選抗原，為乳酸菌作為抗原遞送載體的研究和Hp口服疫苗的開發提供一定的實驗基礎。Gong［14］等應用乳酸菌MG1363作為疫苗載體表達HspA，并進行了動物實驗以研究其免疫預防作用。將hspA基因克隆入pMG36e質粒轉化MG1363，表達的相對分子量為13kD的HspA蛋白可以被HspA抗體血清識別。Kim［15］等應用乳酸菌 MG1363作為疫苗載體表達HpCag12外膜蛋白以研究其口服免疫誘導系統抗Cag12免疫反應。動物實驗結果顯示：口服免疫表達Cag12外膜蛋白的轉化乳酸菌MG1363可以誘導系統的抗Cag12體液免疫反應，這提示表達Cag12外膜蛋白的重組乳酸菌有可能通過口服免疫有效誘導抗Hp的保護性免疫反應。

因此，本研究選用乳酸乳球菌NZ3900與原核表達質粒pNZ8110組成NICE高效誘導表達系統來進行目的蛋白的表達。為了得到較大量的目的蛋白，本研究構建了ureB基因的翻譯融合表達系統，將ureB基因插入pNZ8110質粒啟動子nisA的SD下游，利用啟動子上NcoⅠ酶切位點上的起始密碼子作為翻譯起始密碼子。并進一步采用正交試驗對工程菌株NZ3900/pNZ8110－ureB的誘導表達條件進行了初步優化，確定了目的蛋白表達的適宜條件為：在乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8110－ureB生長至OD600為0.3～0.4時加入40ng/mL的nisin誘導5h，可得到 UreB蛋白27.26μg/mL，較之以往報道外源蛋白在乳酸菌中的表達量有明顯提高［9，16］。Western－blot結果顯示乳酸菌表達的 UreB可被小鼠抗UreB免疫血清識別，說明乳酸菌表達的目的蛋白具有良好的免疫反應性，為進一步的動物學免疫保護性研究的開展奠定了實驗基礎。

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Expression ofHelicobacterpyloriureBgene inLactococcuslactisNZ3900and its immunoreactivity

ZHANG Xiao－juan，ZHANG Rong－guang，DUAN Guang－cai，FAN Qing－tang

（PathogenBiologyStaffRoom，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China）

To lay a foundation for the further study ofHplive oral vaccine，Hpurease subunit B（UreB）was expressed in a food－grade delivery vehicle，andLactococcuslactisNZ3900and its immunoreactivity was studied.The UreB gene was amplified from genome DNA ofH.pyloriMEL－Hp27（GenBank accession no.FJ436980）and then cloned into theE.coli－L.lactisshuttle vector pNZ8110and transformed intoE.coliMC1061.The positive recombinant plasmid was electro－transformed intoL.lactisNZ3900.The conditions of UreB expression in theL.lactistransformant were optimized by orthogonal experiment.Western blot was adopted to confirm whether the UreB expressed byL.lactistransformant had immunoreactivity.As a result，the recombinant engineering bacteria has been successfully constructed through DNA recombinant technique，which were identified by specific PCR and restriction enzyme digestion of recombinant plasmids.The 40ng/mL nisin was added into the medium and induced for 5hwhen the recombinant engineering bacteria grew to logarithmic growth phase（OD600≈0.3－0.4）.The maximum yield ofUreB was 27.26μg/ml of medium，and the maximum percentage ofUreBin cell extracts of theL.lactistransformant reached its peak at 20.19%.Western blot analysis showed that theUreB protein expressed byL.lactistransformant has favorable immunoreactivity.All these results make an appealing case for construction of the food－grade vaccine forHp.

Helicobacterpylori；Lactococcuslactis；NICE；UreB

R378

A

1002－2694（2011）10－0925－04

段廣才，Email：gcduan＠public.zz.ha.cn

1.河南科技大學病原生物學教研室，洛陽 471003；

2010－11－12；

2011－03－08