中國漢賽巴爾通體分離株的多位點序列分型分析＊

趙 帆,宋秀平,栗冬梅,黃儒婷,李志芳,3,劉起勇

中國漢賽巴爾通體分離株的多位點序列分型分析＊

趙 帆1,宋秀平1,栗冬梅1,黃儒婷2,李志芳1,3,劉起勇1

目的 了解中國漢賽巴爾通體的遺傳背景和流行的常見亞型。方法對分離到的漢賽巴爾通體應用多位點序列分型方法(multilocus sequence typing,MLST),分析它們的分子流行病學特征和系統發育情況。結果80株漢賽巴爾通體一共分為3個序列型(sequence type,ST),其中ST1占90%(72/80),ST9占8.75%(7/80),另一個序列型為僅包含一株細菌的ST30;所有3個序列型均屬于克隆群1(clonal comp lex 1)。結論與國外漢賽巴爾通體多位點序列分型結果相比,中國的序列型相對集中,說明中國漢賽巴爾通體的變異度和多樣性較低,提示其進化相對緩慢。

漢賽巴爾通體;多位點序列分型;序列型;克隆群

漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)是巴爾通體屬(Bartonella)中一種重要的人獸共患病病原,為革蘭氏染色陰性的需氧桿菌,其培養條件苛刻,分離難度很大。感染漢賽巴爾通體后,根據人體的免疫狀況不同,身體會有不同的疾病反應:在免疫功能正常的患者中,漢賽巴爾通體主要引起貓抓病(cat scratch disease,CSD)[1-3],而免疫受損患者感染之后則可引起桿菌性血管瘤(bacillary angiomatosis)[4-5]、桿菌性紫癜(bacillary peliosis)[6-7]、培養陰性的心內膜炎[8]、視神經病變等嚴重疾病[9]。

由于病原菌的亞型往往與其致病的能力種類相關,在進行細菌致病的風險因素評估時考慮亞型與疾病的相關性,可以作出更切合實際的預防措施。而目前常用的16S rDNA分型方法僅能將漢賽巴爾通體分成2個亞型,并且兩種都對人類致病[10-11],這促使研究者們選擇更敏感的方法對漢賽巴爾通體進行分型。多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)由 M aiden等研究設計,于 1998年首先應用于自然變異的腦膜炎奈色球菌(N eisseria meningitides)[12],后來被廣泛應用于其他病原菌、環境菌和真核生物中。與傳統分子生物學分型方法相比,MLST具有更高的分辨力,能將同種細菌分為更多的亞型,并確定之間的系統發育關系以及與疾病的聯系[13],因而成為更有前景的檢測和分型方法。2003年,MLST由 Iredell引入到漢賽巴爾通體的分型中[14],經A rvand優化后被廣泛接受[15]。多年以來,各國研究者們使用MLST方法對漢賽巴爾通體進行了大量的分析,結果顯示該方法能夠較為合理地分析菌株間的遺傳進化關系。為進一步了解中國的漢賽巴爾通體菌株的分子流行病學背景,我們對近幾年分離到的漢賽巴爾通體進行了MLST基因分型,并分析了各序列型間的遺傳關系及其與國外分離株間的聯系。

1 材料與方法

菌株來源及培養 實驗所用菌株為本科室自2005年至2010年間從采集到的家貓、家犬和人的全血中分離且經過鑒定的漢賽巴爾通體,共計80株。具體信息見表1。其中,78株貓源漢賽巴爾通體分離自北京市、河南省和山東省三個地區,一株犬源漢賽巴爾通體分離自北京,一株人源漢賽巴爾通體分離自山東。菌株的分離培養和復蘇全部用含5%的無纖維新鮮羊全血瓊脂糖培養基,在37℃、5%CO2的培養箱中培養。選擇漢賽巴爾通體標準株 Houston-1[CIP 103737,G5436](A TCC 49882)為參考菌株。

表1 漢賽巴爾通體分離株基本信息Table 1 General information of B.henselae isolates in this study

1.2 MLST分析

1.2.1 基因組DNA的提取 復蘇保存于-80℃超低溫冰箱中的漢賽巴爾通體分離菌株,傳代一次后收集純培養的細菌菌體,使用 Qiagen公司的DNAeasy試劑盒提取全菌基因組DNA。

1.2.2 PCR擴增 根據文獻中選用的8個管家基因,即 16S rDNA、batR、g ltA、f tsZ、gro EL、nlpD、ribC和rpoB,以及提供的引物序列合成8對擴增引物[14](表2)。引物的擴增條件使用標準菌株優化之后,應用于分離菌株的DNA模板,所有擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶再進行DNA序列分析。引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成,測序工作由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

表2 MLST中所用8個管家基因及其擴增片段大小和引物情況Table 2 Primers used for am plification and sequencing of 8 housekeeping genes for B.hensela e MLST scheme

1.2.3 MLST結果分析 將8個管家基因片段的測序結果與NCB I中對應基因的所有等位基因型進行比較,分別確定每個分離株的等位基因編號,按照文獻提供的順序將各等位基因號依次排列獲得每個分離株的等位基因譜,并確定各自的序列型。搜集國內外目前已經發表的所有序列型,應用eBURST程序分析中國漢賽巴爾通體分離株的序列型在克隆群(clonal comp lex)中的位置,應用M ega 4.0軟件中鄰接法 (neighbor-joining,NJ)基于核苷酸Kimura 2-parameter模型構建系統發育樹。

1.3 統計分析 使用雙側 Fisher’s精確檢驗分析各序列型在分離地點間的差異,P<0.05被認為有顯著性差異。

2 結 果

2.1 MLST結果

2.1.1 標準菌株的MLST基因片段電泳圖譜 在優化的擴增條件下,用標準菌株DNA作模板進行PCR擴增,擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶,如圖1所示。8對引物的擴增產物片段范圍在300-500 bp之間,且經測序后比對完全與網上發布序列一致,為ST1,沒有出現因為傳代或擴增引起的突變。

圖1 標準菌株 Houston-1的8個管家基因片段擴增結果電泳Fig.1 Electrophoresis for amplified products of eight housekeeping genes from reference strain Houston-1 M:marker;con:negative control;PCR product for housekeeping fragments were show n as indicated

2.1.2 分離株的M LST結果 經過8對引物擴增和測序比對之后,80株分離株被分成3種序列型(ST1,ST9,ST30),其中72株為 ST1,占檢測菌株的90%,在三個分離地點均有分布,包括唯一的犬源分離株和人源分離株;7株為ST9,占檢測菌株的8.75%,全部為分離自北京的貓源漢賽巴爾通體;剩下的一株是新發現的序列型ST30,分離自山東省家貓,其管家基因 rpoB序列為首次報道的等位基因型6(allele 6),已經注冊到美國國立衛生院的NCB I網站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上,登錄號為GU 477585.1,序列型ST30的等位基因譜信息也已注冊到 MLST網站(www.m lst.net),可以在漢賽巴爾通體子數據庫中找到。比較3種不同序列型菌株的地理分布(表3),發現ST1和ST9菌株的分離地點之間有顯著性差異(P<0.05),而ST30因為其代表菌株數太少,所以其地理分布不具有統計學意義(P>0.05)。

2.2 MLST序列型的系統進化分析 根據MLST網站信息和文獻報道,將已有的30種序列型及其等位基因譜(表4)錄入eBRUST程序,分析各序列型間的系統發育關系,結果如圖2所示,一共得到4個克隆群;A rvand M報道的獨特性ST7[15]因為更多序列型的發現成為一個新的克隆群。分析中國目前分離株序列型間的相關性,發現序列型ST1、ST9和ST30聚集于克隆群1,其中,ST1和ST30親緣性較近而與ST9相距較遠。但是英國、德國、法國、意大利等歐洲國家分離得到了包括克隆群1～4在內的幾乎所有序列型,與之相比,中國的漢賽巴爾通體序列型則單一而集中,種內多樣性較低。

表3 MLST分析結果Table 3 MLST analysis result

8個管家基因的擴增片段按照相同順序頭尾相接串聯形成一條新序列,將所有序列型各自串聯得到的新序列用M ega 4.0軟件的 neighbo r-joining(NJ)算法分析(圖3)。所有序列型在NJ樹狀圖中得到展現,從總體上顯示出各序列型間的關系。其中,克隆群1所在分支經 bootstrap分析可信度為76%,說明聚集在該群中的序列型親緣性相近,來源于同一個祖先的可能性較大;另外一個可信度為91%的分支,包含了克隆群4的所有序列型。而在eBURST結果中分屬兩個不同的克隆群(克隆群2和3)的序列型,在NJ樹中卻聚到一起,不過此分支的可信度不足50%,是否能被認可還需要更多數據的支持。

圖2 eBURST分析各漢賽巴爾通體序列型間的系統發育關系Fig.2 Phylogenetic relationship between different B.henselae STsas determ ined by eBURST

表4 30個序列型信息Table 4 Profiles for 30 STs

圖3 基于漢賽巴爾通體各序列型的串聯序列構建的 NJ樹(顯示經bootstrap 1000分析可信度高于50%的節點)Fig.3 Neighbor-joining tree of the concatenated sequences of B.henselae STs(value of boostrap 1000 analysisgreater than 50%was shown)

3 討 論

自2003年MLST應用于漢賽巴爾通體的分子分型研究以來,各國的相關研究工作陸續發表。Iredell從37株漢賽巴爾通體分離株中得到了7種序列型[14],幾年之后,A rvand分析了收集自歐洲、美國和澳大利亞的182株漢賽巴爾通體,將序列型擴展到了14種[15]。2010年德國研究者新發現11種序列型[16],隨后英國又發現了多個新的序列型而將總數增加到29。經過統計發現,序列型ST7僅局限于歐洲,ST1、ST5、ST6和 ST8呈世界性分布,但是其中ST5、ST6和ST8常見于歐洲,而 ST1正好相反,在歐洲的分離率較低。提示各序列型有一定的地理分布特點。

本文首次報道了中國漢賽巴爾通體分離株的MLST分析結果。從80株漢賽巴爾通體分離株中我們得到3種序列型(表3),其中世界性分布的序列型ST1占90%。說明漢賽巴爾通體ST1是中國的流行型,且呈廣泛流行趨勢。另外兩種序列型分別占此次分析菌株的8.75%和1.25%,提示中國漢賽巴爾通體分離株序列型單一而集中、種內變異率低。結合 Yanagihara報道的數據[17],日本國內55株漢賽巴爾通體經MLST分析分為三種序列型,94.5%(52/55)的菌株為ST1,其余3株分屬兩個序列型,進一步提示漢賽巴爾通體在亞洲地區進化保守,群體中流行型別單一。

通過系統發育分析我們發現,中國漢賽巴爾通體的3種序列型均屬于克隆群1,雖然ST9與ST1和ST30在克隆群中有一定距離(圖2),但總體上該分支所包含的序列型還是屬于親緣性較高的一群漢賽巴爾通體,其bootstrap 1000分析可信度為76%,說明中國的漢賽巴爾通體雖然發生了少量變異,但是其變異僅在克隆群內部發生,主流序列型為ST1,菌株相對保守和集中,提示漢賽巴爾通體在中國的宿主群中可能尚未發生大規模的變異事件。

由于漢賽巴爾通體的研究在中國還屬于初級階段,可供參考的資料不多。并且臨床醫生對漢賽巴爾通體所致疾病不熟悉,臨床報道僅限于部分醫生的經驗而少有實驗室證據。本文利用近年來從宿主(主要為家貓)中分離到的漢賽巴爾通體菌株,分析其多位點序列分型結果,發現中國家貓中漢賽巴爾通體的流行型ST1,是已被廣泛報道的致病亞型,并且在家犬和人血中分離到的菌株也屬相同的序列型,提示中國存在漢賽巴爾通體感染的危險因素,其感染狀況可能被嚴重忽視,人群中的漢賽巴爾通體流行型有待進一步研究核實。

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Multilocus sequence typing analysis for Bartonella henselae isolates in China

ZHAO Fan,SONG Xiu-ping,L IDong-mei,HUANG Ru-ting,L IZhi-fang,L IU Qi-yong

(State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

To understand the genetic background and epidemiological subtype of Bartonella henselae isolates in China,multilocus sequence typing method was used to analyzed the molecular epidemiological characteristic and phylogenetic relationship for B.henselae.Results showed that 80 B.henselae isolates were belonged to three sequence types(STs).90%isolates was ST1(72/80)and 8.75%was ST9(7/80),whileonly one strain was belonged to a new type ST-ST30.In addition,all the three STs were belonged to clonal complex 1.Compared with the other reports on B.henselae MLST analysis,the STs were centralized in China,suggesting low diversity and evolution speed among B.henselae isolates in China.

Bartonella henselae;multilocus sequence typing;sequence type;clonal comp lex

R181.2

A

1002-2694(2011)07-0592-05

＊重要病媒生物監測和傳播相關病原體檢測技術研究(2008ZX10004-010);傳染病防治科技重大專項“傳染病監測技術平臺”細菌性傳染病病原體流行規律及變異研究(2009ZX10004-203)

劉起勇,Email:liuqiyong@icdc.cn

1.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所媒介生物控制室,傳染病預防控制國家重點實驗室,北京 102206;2.北京市豐臺區疾病預防控制中心,北京 100071;3.鄭州大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室,鄭州 450001

2011-01-16;

2011-04-24