川北地區胃癌特異性表達基因的克隆

王朝莉，李 麗，陳 果，楊尚君，敬保遷，任碧軒，馮 莉

（川北醫學院分子生物學研究所，四川南充 637000）

川北地區胃癌特異性表達基因的克隆

王朝莉，李 麗，陳 果，楊尚君，敬保遷*，任碧軒，馮 莉

（川北醫學院分子生物學研究所，四川南充 637000）

目的：構建胃低分化腺癌組織cDNA消減文庫，篩選胃癌特異表達基因。方法：取胃低分化腺癌組織和癌旁正常黏膜組織，提取總RNA，逆轉錄cDNA，進行SSH構建消減文庫獲得序列標簽，與載體連接、克隆、篩選、測序及同源性檢索。結果：以癌旁正常黏膜組織為driver、胃低分化腺癌組織為tester成功構建cDNA消減文庫，測序結果與公共數據庫中已知基因和人類EST比較，獲得5個特異性序列標簽（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。結論：應用SSH法成功構建胃低分化腺癌組織cDNA消減文庫，初步篩選胃癌部分表達基因，為尋找川北地區胃癌發生發展的特異性基因奠定基礎。

胃癌；SSH；特異基因

胃癌是嚴重危害人類健康和生命的惡性腫瘤之一，我國每年有20余萬例新發胃癌患者，占全部惡性腫瘤患者的17.2%，其發病率居所有惡性腫瘤發病率之首。每年胃癌患者死亡人數占所有癌癥死亡人數的23.93%。由于胃癌起病隱匿，發生的確切機制至今尚不清楚，臨床早期70%以上毫無癥狀，中晚期才引起相應的臨床癥狀，且易轉移與復發，預后極差。目前最為緊迫的是尋找對胃癌檢測靈敏度高、特異性好的檢測方法，使其能對胃癌高危險患者進行篩查、對早期胃癌能特異診斷、對病情發展和療效可追蹤考核，從而提前對高危患者給予干預治療。本實驗采用SSH技術，以胃低分化腺癌組織為tester，癌旁正常黏膜組織為driver，期望克隆出可能載有高度特異性目的片段，探索川東北地區胃癌不同發展階段的基因表達變化，為進一步闡明胃癌的發病機制、開展胃癌的基因診斷和基因治療提供重要的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 標本收集

胃癌組織和癌旁正常黏膜組織來源于川北醫學院附屬醫院的胃癌患者，胃癌組織標本術后經川北醫學院附屬醫院病理科鑒定為低分化腺癌。

1.2 主要化學試劑

RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取總RNA；PCR Select cDNA Subtraction試劑盒，50×PCR EnzymeMix，AdvantagePCRCloning試劑盒為美國 Clontech公司產品；NucleoSpin ExtractⅡ（Clontech）和PCR Purification（Qiagen）純化相應產物；抑制性PCR產物以T／A方式接入pGEM-T（Promega）載體；文庫擴增使用感受態大腸桿菌JM109；氨芐青霉素（50 mg／L）及顯色劑X-Gal／IPTG（Gibco）篩選克隆。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的制備 取上述胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜組織，1%PBS（含0.1%DEPC）緩沖液洗滌3次，用RNeasy Mini Kit（Qiagen）試劑盒，按使用說明提取癌組織和癌旁組織總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定質量。

1.3.2 cDNA合成 使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit（Clontech），參照使用說明，取胃癌組織和癌旁組織總RNA各2 μl（2 μg），以RT-PCR方法擴增合成雙鏈cDNA，產物經NucleoSpin ExtractⅡ（Clontech）純化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物質量。

1.3.3 消減雜交及抑制性PCR以PCR Select cDNA Subtraction試劑盒（Clontech）進行。以限制性內切酶RsaI消化等量胃癌組織和癌旁組織cDNA，純化并回收其產物。以酶切后的癌組織cDNA為tester，癌旁組織為driver，一份tester cDNA與Adaptor 1連接，一份tester cDNA與Adaptor 2R連接，分別將帶有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA片段與等量的driver cDNA混合進行第一次消減雜交，然后將兩者雜交后產物和另一份driver cDNA混合進行第二次消減雜交。

以稀釋后的第二次消減雜交產物為模板，以試劑盒中的引物1進行第一輪抑制性PCR擴增，反應參數為：75℃5 min后，94℃30sec，以94℃30sec、66℃30sec、72℃1.5 min，27個循環，最后72℃6 min。再將稀釋后的第一輪PCR產物作為模板，以試劑盒中的巢式PCR引物1和引物2進行第二輪PCR擴增，反應參數為：94℃30sec、68℃30sec、72℃1.5 min，20個循環。以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定質量，并以PCR Purification（Qiagen）純化PCR產物。

1.3.4 cDNA消減文庫的構建、克隆與測序 將上述PCR產物與pGEM-Tasy（Promega）載體連接，轉化經CaCl2處理的大腸桿菌JM109，鋪于（含X-Gal，IPTG，Amp）LB平板，藍白斑篩選和快速瓊脂糖凝膠電泳方式篩選陽性克隆，隨機挑選29個克隆送上海基康生物技術有限公司進行測序，以所測定的DNA序列為基準序列，通過GenBank檢索和同源性分析。

2 結果

2.1 胃癌組織鑒定

本實驗所用胃癌組織標本和癌旁正常黏膜組織標本均經川北醫學院附屬醫院病理科鑒定證實。

2.2 總RNA和cDNA的合成

用Qiagen公司產總RNA快速制備試劑盒提取胃低分化腺癌組織和胃正常黏膜組織的總RNA （圖1），用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit（Clontech）合成cDNA。結果顯示，無論是在胃低分化腺癌組織中還是胃正常黏膜組織中都存在相應基因的大量表達，為構建消減文庫奠定基礎。

2.3 胃癌特異表達基因片段的制備

以RsaⅠ酶切的胃癌cDNA為tester，正常組織cDNA為driver進行SSH和抑制性PCR，產物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示，在200～800bp范圍內的存在一系列基因片段（圖2）。

2.4 胃癌cDNA消減文庫的構建、測序及序列分析

經過pGEM-T載體連接的序列片段由JM109菌克隆，存在大量的陽性重組子，選取有明顯條帶的克隆進行序列測定，獲得5個特異性序列標簽（NBPF1、FAM48A、RXFP2、 QDPR和ACTB）。

3 討論

本實驗采用SSH對胃低分化腺癌組織和胃正常黏膜組織提取的RNA進行逆向PCR合成cDNA，產物經RsaⅠ酶切后連上接頭，進行消減雜交，測序結果獲得5個特異性序列標簽（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。NBPF1基因（neuroblastoma breakpoint family，member 1）：NBPF基因是一種在基因復制過程中出現相互易位產生的融合基因家族，Sherif ZA等[1]報道其與乳腺癌有關，Sossey-Alaoui K等[2]報道其與腎上腺神經節神經母細胞瘤 （Ganglioneuroblastoma）有關，Roberts T等[3]報道與惡性成神經細胞瘤有關；RXFP2基因（relaxin/insulin-like family peptide receptor 2）是松弛素家族肽受體的成員，富含亮氨酸的G蛋白偶聯受體，在細胞的代謝過程中能引起cAMP的升高[4]，Halls ML等[5]報道其隱睪病和不育癥有關；QDPR基因（quinoid dihydropteridine reductase）：醌型二氫喋呤還原酶基因，位于4p15.3，在BH4的循環中起關鍵作用，Farrugia R等[6]報道其突變會導致BH4的循環障礙，導致高苯丙氨酸血癥和苯丙酮癥的產生，Schochet TL等[7]報道其與青少年的吸煙有一定的關聯，Lee PL[8]報道其與哺乳動物飲食中的三價鐵離子的還原有一定的關系；FAM48A基因：亦稱C13orf19，Kunze D等[9]和Schmidt U等[10]報道其與前列腺癌有關。以上這四種基因與胃癌的發生、發展未見相關的文獻報道。ACTB基因（actin beta）：細胞骨架蛋白基因，Humar B等[11]報道其與彌散型胃癌有一定的關系。我們將深入研究這些基因的功能及其與胃癌的作用機制。

本研究采用SSH技術從整體層次對川北地區臨床胃低分化腺癌組織和胃黏膜正常組織差異表達基因進行篩選，所篩選到的基因應是與胃癌的發生發展密切相關的基因，觀測這些基因在胃癌發生發展中的變化，可以從分子水平揭示川北地區胃癌的發病機制，比較這些基因在胃癌和其他腫瘤中的表達變化，可以篩選到具有川北地區特異性表達的胃癌基因，可以發展川北地區對胃癌具有篩查和早期實驗室診斷的方法以及具有特異性治療和預防的手段。

[1]Sherif ZA,Danielsen M.Balanced t(11;15)(q23;q15)in a TP53+/+ breast cancer patient from a Li-Fraumeni syndrome family[J].Cancer Genet Cyt-ogenet,2006,168(1):50-58.

[2]Sossey-Alaoui K,Su G,Malaj E,et al.WAVE3,an actin-polymerization gene,is truncated and inactivated as a result of a constitutional t(1;13) (q21;q12)chromosome translocation in a patient with ganglioneuroblastoma [J].Oncogene,2002,21(38):5967-5974.

[3]Roberts T,Chernova O,Cowell JK.NB4S,a member of the TBC1 domain family of genes,is truncated as a result of a constitutional t(1; 10)(p22;q21)chromosome translocation in a patient with stage 4S neuroblastoma[J].Hum Mol Genet,1998,7(7):1169-1178.

[4]Halls ML,Bathgate RA,Summers RJ.Relaxin family peptide receptors RXFP1 and RXFP2 modulate cAMP signaling by distinct mechanisms[J]. Mol Pharmacol,2006,70(1):214-26.

[5]Halls ML,Van der Westhuizen ET,Bathgate RA,et al.Relaxin family peptide receptors--former orphans reunite with their parent ligands to activate multiple signalling pathways[J].Br J Pharmacol,2007,150(6):677-691.

[6]Farrugia R,Scerri CA,Montalto SA,et al.Molecular genetics of tetrahydrobiopterin(BH4)deficiency in the Maltese population[J].Mol Genet Metab, 2007,90(3):277-283.

[7]Schochet TL,Kelley AE,Landry CF.Differential expression of arc mRNA and other plasticity-related genes induced by nicotine in adolescent rat forebrain[J].Neuroscience,2005,135(1):285-297.

[8]Lee PL,Halloran C,Cross AR,et al.NADH-ferric reductase activity associated with dihydropteridine reductase[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,271(3):788-795.

[9]Kunze D,Fuessel S,Meye A,et al.Functional analyses of C13orf19/P38IP in prostate cell lines[J].Oncol Rep,2006,5(6):1599-1604.

[10]Schmidt U,Fuessel S,Haase M,et al.Quantification of C13orf19/P38IP mRNA expression by quantitative real-time PCR in patients with urological malignancies[J].Cancer Lett,2005,225(2):253-260.

[11]Humar B,Fukuzawa R,Blair V,et al.Destabilized adhesion in the gastric proliferative zone and c-Src kinase activation mark the development of early diffuse gastric cancer[J].Cancer Res,2007,67(6):2480-2490.

Cloning associated special genes in gastric cancer of North Sichuan Area

WANG Chaoli,LI Li,CHEN Guo,YANG Shangjun,JING Baoqian*,REN Bixuan,FENG Li
（Molecular biology research institute of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China)

Objective:To construct cDNA subtracted libraries from gastric poorly differentiated adenocarcinoma and screen differentially expressed genes.Methods:Relatively pure gastric poorly differentiated adenocarcinoma and normal gastric mucous membrance were procured,and abstracted the total RNA,and the cDNA was been reversed transcription, which was used to carry on for suppression subtractive hybridization(SSH).Subtracted cDNA fragments were linked with vector,cloned,screened,sequenced,and made homologous search.Results:The subtracted cDNA libraries were constructed with the tester of gastric poorly differentiated adenocarcinoma and the driver of normal mucosa tissue beside of the dysplasia.The sequenced result compared with the known genes of PubMed and human EST and five specificity sequences were procured(NBPF1,FAM48A,RXFP2,ACTB and QDPR).Conclusion:Subtracted cDNA libraries from gastric poorly differentiated adenocarcinoma using SSH.Some fragments have been screened and verified to help to search for novel associated genes with gastric cancer of North Sichuan Area.

Gastric cancer;Suppression subtractive hybridization;Special gene

R735.2

A

1673-7210（2011）02（b）-019-03

*通訊作者

2010-12-10）