高效液相色譜法同時測定清濁祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷、丹皮酚含量

黎 強，張曉娟，鐘明利

(1.廣西壯族自治區玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000; 2.廣西桂林醫學院，廣西 桂林 541004)

高效液相色譜法同時測定清濁祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷、丹皮酚含量

黎 強1，張曉娟1，鐘明利2

(1.廣西壯族自治區玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000; 2.廣西桂林醫學院，廣西 桂林 541004)

目的建立同時測定清濁祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的高效液相色譜法。方法采用Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，用甲醇 －0.1%磷酸流動相進行梯度洗脫，流速 1.0 mL/min，檢測波長 314 nm，進樣量 5 μL。結果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚質量濃度線性范圍分別是 4.8 ～96.0 μg/mL(r=0.999 5， n=5)，4.1 ～82.0 μg/mL(r=1.0， n=5)和 12.0 ～240.0 μg/mL(r=0.999 9，n=5)，平均加樣回收率分別為 101.10%(RSD=1.6% ，n=9)，101.62%(RSD=0.8% ，n=9)，102.71%(RSD=1.2% ，n=9)。結論該法方便、快捷、準確、靈敏、重現性好，能更全面地控制清濁祛毒丸的質量。

清濁祛毒丸;咖啡酸;虎杖苷;丹皮酚;高效液相色譜;含量

The linear ranges of caffeic acid，polydatin and paeonol were 4.8 － 96.0 μg/mL(r=0.999 5， n=5)，4.1 － 82.0 μg/mL(r=1.0， n=5)and 12.0 － 240.0 μg/mL(r=0.999 9， n=5)，respectively.The average recovery rates were 101.62% (RSD=0.8% ， n=9)for polydatin，101.10% (RSD=1.6% ， n=9)for caffeic acid and 102.71%(RSD=1.2% ， n=9)for paeonol respectively.Conclusion The method is simple，rapid，accurate and sensitive with good reproducibility，which is suitable for fully controlling the quality of Qingzuoqudu Pills.Key words:Qingzhuoqudu pills;caffeic acid;polydatin;paeonol;HPLC;content determination

清濁祛毒丸由蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黃、山茱萸等12味中藥制成，能清熱解毒、利濕祛暑，用于治療濕熱下注所致尿頻、尿急、尿痛等。現行標準中其質量控制方法為用紫外分光光度法測定丹皮酚的含量[1]，但該法操作較為煩瑣。本試驗用高效液相色譜(HPLC)法同時測定清濁祛毒丸的咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量，能更全面地控制清濁祛毒丸的質量。

1 儀器與試藥

1100 Series高效液相色譜儀(安捷倫);TU－1221型紫外－可見分光光度計(北京普析通用);AE240型電子分析天平(梅特勒－托利多);SB2200型超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)。對照品咖啡酸(批號為 885－200001)，虎杖苷(批號為 111575－200301);丹皮酚(批號為0780－9704)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇、磷酸(色譜純)，一級純化水;清濁祛毒丸(批號為081102，090701，090801，090504，廣西玉林大清藥業有限公司);大血藤、蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黃、山茱萸等12味藥材(市售品)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱為 AgilentEclipse XDB －C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以甲醇為流動相 A，0.1% 磷酸為流動相B，按表1進行梯度洗脫，流速為 1.0 mL/min，檢測波長為314 nm，柱溫40℃，進樣量5 μL。在上述色譜條件下，3個組分峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數按咖啡酸、虎杖

表1 梯度洗脫條件

2.2 溶液制備

取清濁祛毒丸10袋，研成粉末，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理45 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，殘渣再加10 mL甲醇，稱定質量，超聲處理10 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，合并濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，續濾液即為供試品溶液。另分別取咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚對照品適量，精密稱定，以甲醇為溶劑，制成質量濃度分別為 0.143 4，0.515 6和1.840 8 g/L的對照品貯備液以及質量濃度為咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷4.8 mg/mL及丹皮酚1.2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性對照試驗:取按處方制備的分別不含蒲公英、虎杖和牡丹皮原藥材的樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液試驗。結果在咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚的對應峰位上未出現色譜峰，說明陰性對照品溶液對測定無干擾(見圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密吸取混合對照品貯備液(咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷 4.8 mg/mL，丹皮酚 1.2 mg/mL)0.1，0.2，0.4，1.0，2.0 mL，置 10 mL 量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質量濃度的對照品混合溶液，進樣測定峰面積，以對照品質量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線回歸方程見表2。

表2 線性關系考察結果

精密度試驗:將混合對照品貯備液稀釋10倍，重復進樣5次測定。結果峰面積、咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面積的 RSD分別為 0.8% ，0.2%，0.3%(n=5)。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，在室溫避光條件下，分別于0，2，4，8，12，24 h 時進樣，考察保留時間及峰面積的一致性。測得樣品中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面積的 RSD分別為1.4%，1.5% ，1.6%(n=6)。

重復性試驗:取同一批(批號為081102)清濁祛毒丸樣品，平行制備6份供試品溶液，進樣分析。結果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的平均值分別為 0.167 9，0.847 3，2.209 0 mg/g，RSD 分別為2.2% ，1.7%，2.3%。

加樣回收試驗:分別取已知含量的樣品(批號為081102)9份，每份約 1.0 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液 1.0，1.5，2.0 mL，每一濃度制備3份，揮干溶劑后測定各成分的含量并計算回收率。咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚的平均回收率為101.1%，101.6%，102.7%，RSD 分別為 1.6% ，0.8%，1.2%(n=9)。

2.4 樣品含量測定

另取3批樣品，依法制備供試品溶液，進樣測定峰面積以外標法計算咖啡酸。虎杖苷及丹皮酚含量結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

3 討論

虎杖苷又名白藜蘆醇苷，具有抗癌、抗菌消炎、抗氧化等生物學作用[2]，因其屬于二苯乙烯類化合物，在光照條件下不穩定，容易向其異構體或衍生物轉化，導致含量降低，故須避光操作[3]。

取適當濃度的咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚對照品溶液，在波長200～400 nm范圍內做吸收光譜掃描，結果咖啡酸在323和217 nm波長處有最大吸收，虎杖苷在307和217 nm波長處有最大吸收，丹皮酚在314，274，228和213 nm波長處有最大吸收。經比對，各成分在314 nm波長處吸收較好，故最后選擇314 nm為測定波長。

在色譜條件篩選試驗中，對流動相比例及酸度、梯度洗脫時間、柱溫以及進樣量做了考察，結果以本試驗的色譜條件為最佳。

提取方法[4－6]選擇時，樣品中咖啡酸的含量較少，故需要加大取樣量。考察了甲醇、50%甲醇、乙醇等溶劑，發現甲醇的提取效率最高。而提取方法以超聲提取效果最好，并且二次超聲提取效率最高。故確定提取方法為超聲處理45 min，過濾后殘渣再加10 mL甲醇超聲處理10 min，合并濾液。

[1]WS－10279(ZD －0279)－2002，國家藥品標準(試行)[S].

[2]劉樹興，程麗英.虎杖有效成分的開發現狀及展望[J].食品科技，2005(2):96－98.

[3]馬麗艷，劉彥雷，梁學軍，等.貯藏條件對葡萄酒中白藜蘆醇的影響[J].中外葡萄與葡萄酒，2005(6):9.

[4]曾秋華，劉文京，唐曉暉.高效液相色譜法測定蒲公英顆粒中咖啡酸含量[J].中國藥業，2007，l6(3):26.

[5]周丹丹，趙云麗，張 艷，等.RP－HPLC法同時測定乙肝舒康膠囊中虎杖苷和二苯乙烯苷含量[J].藥物分析雜志，2008，28(3):411.

[6]張翠英，李忠保，李振國，等.HPLC測定六昧地黃顆粒中馬錢苷和丹皮酚含量[J].中成藥，2008，30(12):1 791 －1 794.

Simultaneous Determination of Caffeic Acid，Polydatin and Paeonol in Qingzhuoqudu Pills by HPLC

Li Qiang1， Zhang Xiaojuan1， Zhong Mingli2
(1.Yulin Institute for Food and Drug Control， Yulin， Guangxi， China 537000; 2.Guilin Medical College， Guilin， Guangxi， China 541004)

ObjectiveTo establish a HPLC method for simultaneous determination of caffeic acid，polydatin and paeonol in Qingzhuoqudu Pills.Methods The Agilent Eclipse XDB － C18column(250 mm ×4.6 mm，5 μm)was used with the mobile phase of methanol－0.1%phosphoric acid.The flow rate was 1.0 mL/min and the UV detection wavelength was set at 314 nm.The sample size was 5 μL.Results

R284.1;R286.0

A

1006－4931(2011)10－0038－02

2010－03－12)